[發明專利]Vero細胞裂解蛋白、制備方法及其用途

有效

• 申請號: 200810043319.7
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101570566A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 史晉;施松明;姚越;劉毅
• 申請（專利權）人: 上海澤潤生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/16
• 分類號: C07K1/16;C07K1/34;G01N33/68
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司
• 代理人: 王 裕;呂 伴

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及Vero細胞裂解蛋白、制備方法及其 用途。

背景技術

Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)是一種理想的疫苗生產基質，其遺傳背景 清楚，核型穩定，無外源因子污染，適合大規模培養，可用生物反應器生產， 保證了疫苗大批量生產的均質性和安全性。多年來，國外已成功的研制了多 種采用Vero細胞生產的疫苗并獲準上市，包括人用狂犬病純化疫苗、脊髓灰 質炎滅活(純化)疫苗(IPV)、乙型腦炎滅活疫苗(JE)。采用Vero細胞生 產的疫苗有兩種生產方式：其一為分泌型病毒培養方式(病毒復制完成后， 分泌到細胞外的培養液中)；在分泌型病毒培養過程中，其病毒為利用細胞環 境進行病毒復制，造成宿主細胞結構受損，導致細胞死亡，致使細胞破裂后 釋放大量的宿主細胞結構蛋白于培養液中；同時由于細胞生長增殖需要，在 Vero細胞生長增殖的過程中會向培養液中釋放大量的促細胞生長因子。其二 為非分泌型病毒培養方式，即病毒在宿主細胞內培養(病毒復制完成后，病 毒存在于宿主細胞內)，非分泌型病毒如甲肝病毒等在宿主細胞內的培養過程 中，病毒的復制不會對宿主細胞產生病變，因此，此類病毒的釋放需要采取 物理或化學的方法破碎細胞；在收獲的病毒液中，除了含有細胞生長增殖過 程中釋放的促細胞生長因子外，還存在大量的由于細胞破碎而產生的成份更 為復雜的細胞裂解蛋白。

經過多年的臨床應用，證明Vero細胞作為疫苗生產基質是安全、有效的。 但與此同時，不能排除Vero細胞生產疫苗在理論上的潛在致腫瘤性風險。控 制該風險的措施有兩個：其一為控制Vero細胞的代次在130～150代，其二為 降低Vero細胞殘余DNA含量、Vero細胞殘余蛋白含量。鑒于目前國際上尚 無特異性Vero細胞蛋白的檢測手段，現仍以疫苗蛋白總量進行間接質量控制。 (高恩明et?al.國家食品藥品監督管理局藥品評審中心《關于Vero細胞疫苗 殘余物質的考慮》，20070112)。而這種情況下，未檢出的殘余宿主細胞蛋白 (Host?Cell?Protein，HCP)中的某些組分有可能成為疫苗中的過敏原，因此 WHO于1998年組織制定了《使用動物細胞作為細胞基質生產生物制品規程》， 要求將傳代細胞HCP含量降低至可接受水平。這一舉動表明WHO已開始關 注HCP的含量及其對于疫苗安全性的影響。

田博和丁志芬報道了定量檢測疫苗中Vero細胞HCP(田博、丁志芬，中 國生物制品雜志.2005，18(2)：159-161，164)；王輝等也報道了疫苗制品中Vero細 胞殘余蛋白的檢測(王輝、張月蘭、過琴媛等.中國生物制品雜志.2007，20(2)： 937-939，947)。但上述文章中所述Vero細胞殘余蛋白檢測方法僅針對分泌型病 毒培養所制備的疫苗中殘余宿主蛋白的檢測，并不適用于非分泌型病毒培養 所制備的疫苗中殘余宿主蛋白的檢測。因此，上述文獻中所述疫苗中Vero細 胞HCP的檢測方法尚存在不足。

目前，市面上也沒有出售用于檢測Vero細胞HCP殘余量的試劑盒，其原 因主要在于HCP殘余量檢測過程中需要的幾種物質難以制備：其中之一就是 Vero細胞裂解蛋白，它可以作為免疫原免疫動物產生抗體-該抗體可用于后 續檢測反應；并在檢測過程中起著試驗標準品的作用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供了檢測Vero細胞HCP的標準品和抗 原，以備在疫苗生產和質檢中檢測Vero細胞HCP殘余量。

為了解決上述技術問題，

一方面，本發明公開了一種制備Vero細胞裂解蛋白的方法，包括下述步 驟：

a)Vero細胞培養、收獲；

b)細胞破碎裂解；

c)Vero細胞裂解蛋白的純化；

d)濃縮處理，即為Vero細胞裂解蛋白。

其中，所述細胞破碎裂解包括細胞化學裂解、滲透破碎、反復凍融、細 胞酶裂解、超聲波破碎和細胞機械裂解，優選超聲波破碎；

所述純化包括粗純化和精純化步驟，粗純化方法包括等電點沉淀法、鹽 析法和有機溶劑抽提法，優選有機溶劑抽提法。精純化為層析法，包括分子 篩層析法、離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法、金屬離子螯合層 析法、共價層析法。