[發明專利]一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達載體及其應用

有效

• 申請號: 200810042301.5
• 申請日: 2008-08-29
• 公開（公告）號: CN101659959A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發明（設計）人: 穆海東;汪寧梅;劉綱;任韌
• 申請（專利權）人: 上海裕隆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N15/12;C12P21/04;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明屬于遺傳工程技術領域，具體地說涉及一種人重組角蛋白19的抗原活性片 段表達載體，以及利用該重組載體進行抗原表達的方法。

二、技術背景

角蛋白是細胞體的中間絲，具有中心性高度保守的α-螺旋桿狀區域以及高度變異 的氨基和羧基末端區域分布在周圍。角蛋白的DNA序列研究表明，角蛋白多肽是基因 轉錄的產物，而不是蛋白水解片段。根據角蛋白相對分子質量及等電位點，用二維電泳 可將人類上皮細胞角蛋白分離出20個條帶，分別命名為CK1-20，其pI值為5.2～7.8， 分子質量為40000～60000，這些角蛋白分兩型：I型具有酸性等電點，分子質量從40 000～56500不等；II型具有中性或堿性等電點，分子質量從52000～67000不等。細胞 角蛋白是由I型和II型角蛋白組成的異聚合體。所有的細胞角蛋白都有一個共同的分子 結構，它是組成不同類型復合物和細絲的基本單位。這些角蛋白遍及人類上皮細胞，正 常人上皮組織主要表達CK5，6，8，14，15。

角蛋白19(CK19)的相對分子質量為40000，是一種酸性多肽，是最早在鱗癌細胞 中檢測出來的分子量最小的角蛋白，CK19的cDNA序列由1349bp組成，包括一個 1200bp的開放閱讀框，起始于33位核苷酸，起始密碼子為ATG，終止于1233位核苷 酸。CK19的免疫組化研究表明，覆蓋正常支氣管樹的單層上皮、肺泡表面及呼吸道上 皮來源的腫瘤均有CK19表達，但不同組織學類型的癌細胞其CK19的表達強度不同， 小細胞肺癌最弱、鱗癌最強、腺癌次之。

CYFRA21-1是角蛋白19的可溶性片段，由于可用兩種單克隆抗體KS19-1和 BM19-21檢測到，因而命名為CYFRA21-1。正常時CYFRA21-1以寡聚物形式存在， 含量極低。當分布有CK19的細胞惡變時，可釋放CYFRA21-1進入血液循環。過去10 年中，大量的臨床研究資料已充分證實，由KS19-1和BM19-21兩株抗體針對定量檢測 血清中CYFRA21-1而配對組成測定方法，使得CYFRA21-1成為非小細胞肺癌患者最 有價值的血清腫瘤標記物，對非小細胞肺癌的診斷、病情監視和療效判斷有較高的臨床 應用價值。

在體外獲得CK19抗原可以用作生產相應CK19抗體的免疫原或是體外診斷試劑盒 的標準品。目前市面上出售的CK19抗原多為進口，因采用天然提取的方法獲得(如 Fitzgerald公司生產的來源于人源細胞株的CYFRA21-1)，故生產成本高，得率少，價 格昂貴。平均每mg價格約為3000-5000元。而少數一些公司也有利用基因重組的方式 在體外表達CK19抗原(如中資漢脈公司生產的編碼CK191-401aa全長基因的CK19重 組蛋白)，但是因錯配率高通過普通PCR的方法得到編碼CK19的全長基因比較困難；而 且根據這段全長基因構建表達載體表達的重組蛋白抗原活性不高，達不到天然提取物的 水平，并且穩定性差。因此有必要提供一種生產成本低、抗原活性高、穩定性又好的基 因重組蛋白。

三、發明內容

為了克服以上角蛋白19抗原產品的不足，本發明提供一種人重組角蛋白19抗原的 活性片段表達載體及其制備方法，以及利用該表達載體制備該活性片段的方法。

本發明的目的是這么實現的：

構建一種人重組角蛋白19抗原活性片段表達載體，是克隆有序列表中核苷酸序列3 的大腸桿菌表達載體，所述序列表中核苷酸序列3包含在編碼角蛋白19的cDNA全長 序列中，并且含有兩個單抗BM19-21、KS19-1結合表位的編碼序列；所述的大腸桿菌 表達載體為pTrc-CKS。

天然CK19的cDNA序列由1349bp組成，包括一個1200bp的開放閱讀框。而 Cyfra21-1為角蛋白19(CK19)的可溶性片段，其序列包含在CK19cDNA全序列中。 Cyfra21-1結構含有親水性的棒狀體部和疏水性的頭尾，抗體表位為氨基酸鏈 QLADVRADSERQNQ及KAALEDTLAETEARFKS，兩個抗體表位分別對應單抗 BM19-21與單抗KS19-1。