[發(fā)明專利]一種用于個(gè)體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩查的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810040318.7
• 申請(qǐng)日: 2008-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN101560547A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 傅詠南;邵敏華;宋艷絨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 翁若瑩

1.一種用于個(gè)體氨基糖苷類藥物致聾致殘篩查的方法，其特征在于，其方法為：

步驟1，用采樣拭在一個(gè)被測(cè)者口腔中左右兩腮至少需要各上下刮40-60次，以保證采集到足量的細(xì)胞樣本；

步驟2.基因組DNA的抽提方法：

采用硅膠吸附法抽提步驟1被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，抽提時(shí)間為2-3小時(shí)，共抽提2個(gè)樣本，采用電泳凝膠成像法對(duì)基因組DNA濃度和純度作檢測(cè)，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測(cè)；

步驟3.基因分型

將每一個(gè)被測(cè)者樣本分別放入2個(gè)反應(yīng)孔，1個(gè)反應(yīng)孔檢測(cè)961、1095位點(diǎn)，另一個(gè)1個(gè)反應(yīng)孔檢測(cè)1494、1555位點(diǎn)，每一個(gè)反應(yīng)孔分別測(cè)2個(gè)位點(diǎn)的基因分型采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增、凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)純度、測(cè)序技術(shù)對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行基因型進(jìn)行確定：

3-1，反應(yīng)體系配置

在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的引物濃度為10uM，反應(yīng)體系總體積為20ul，其中QPCR?MIX即PCR定量試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的DNA模板3μl，去離子水11.2ul；

檢測(cè)961、1095位點(diǎn)的線粒體DNA?611-1411正向和反向引物：

正向引物：CTCCTCAAAGCAATACACTG

反向引物：TGCTAAATCCACCTTCGAGC

檢測(cè)1494、1555位點(diǎn)的線粒體DNA?1245-2007正向和反向引物：

正向引物：CGATCAACCTAACCACCTCT

反向引物：TGGACAACCAGCTATCACCA

3-2，PCR反應(yīng)條件

將2個(gè)反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱95℃15分鐘；再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分鐘后降溫至4℃；

3-3，將2個(gè)反應(yīng)孔在PCR擴(kuò)增儀反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)：

a.1％瓊脂糖凝膠插小號(hào)孔梳子；

b.2000bp?DNA?marker即DNA標(biāo)記物：6ul

c.PCR產(chǎn)物：4ul+電泳緩沖液r：1ul

d.電泳電壓：120v

e.電泳時(shí)間：20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖

7個(gè)樣本PCR后產(chǎn)物，25ng/ul的電泳結(jié)果圖，目的條帶800bp左右；

7個(gè)樣本PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖為：

3-4，純化

終濃度：PCR產(chǎn)物純化試劑0.2U?SAP+PCR產(chǎn)物純化試劑2.5U?EXON1/7ul；

在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為7ul、去離子水ddH2O3.825ul、PCR產(chǎn)物純化試劑SAP?0.05ul、PCR產(chǎn)物純化試劑EXON10.125ul、PCR產(chǎn)物3ul；反應(yīng)條件為：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒溫保存；

3-5，將純化后的每一個(gè)反應(yīng)孔進(jìn)行測(cè)序，引物濃度為1uM，設(shè)備ABI?3730測(cè)序儀；

3-5-1，從-20度冰箱中取出PCR純化產(chǎn)物、測(cè)序試劑MIX、測(cè)序緩沖液seq?buffer、1uM引物，測(cè)序引物：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC；

3-5-2，記錄日期、所作反應(yīng)的PCR純化產(chǎn)物名、所用引物、反應(yīng)體系、MIX用量、PCR反應(yīng)條件；

3-5-3，取一塊反應(yīng)板，表上模板名、引物名、日期；

3-5-4，每個(gè)樣本需做兩個(gè)PCR反應(yīng)，用兩個(gè)反應(yīng)孔，其中一個(gè)加入第一組引物，檢測(cè)961、1095位點(diǎn)的線粒體DNA?611-1411正向和反向引物，另一個(gè)加入另一組引物，檢測(cè)1494、1555位點(diǎn)的線粒體DNA?1245-2007正向和反向引物；

3-5-5，在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為0.5ul的測(cè)序試劑mix3.1、1.4ul的測(cè)序緩沖液sequence?buffer、2ul的測(cè)序引物1uM?primer、3ul的PCR純化產(chǎn)物、0.1ul的去離子水ddH2O；體系分裝好后，上離心機(jī)，達(dá)900轉(zhuǎn)/分即停；

3-5-6，將反應(yīng)板放在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)熱96℃10秒；再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分鐘；60℃、4分鐘后降溫至4℃恒溫保存；

3-5-7，擴(kuò)增結(jié)束后，在每孔加入1ul?125mM乙二胺四乙酸EDTA；

3-5-8，再在每孔加入100％乙醇15ul于室溫進(jìn)行沉淀，不得超過24小時(shí)；

3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機(jī)，3650轉(zhuǎn)/分，4℃離心30分鐘；

3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板導(dǎo)致離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，再在每孔加30ul70％乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板導(dǎo)致離心，達(dá)800轉(zhuǎn)即停，將殘余酒精風(fēng)干，室溫放置20分鐘；

3-5-11，每孔加入8ul的95％甲酰胺，5％ddH2O；

3-5-12，在ABI?3730上進(jìn)行結(jié)果讀取，用網(wǎng)上免費(fèi)下載軟件Chromas查閱測(cè)序檢測(cè)結(jié)果：每一個(gè)被測(cè)者4個(gè)位置分別有4個(gè)結(jié)果；

通過5000-10000個(gè)被測(cè)者的檢測(cè)，歸納出：961位置實(shí)驗(yàn)有3種結(jié)果，即正常結(jié)果、T缺失突變結(jié)果和C插入突變結(jié)果；1095位置實(shí)驗(yàn)有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；1494位置實(shí)驗(yàn)有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；1555位置實(shí)驗(yàn)有2種結(jié)果，即正常結(jié)果和突變結(jié)果；

步驟4，結(jié)果分析

根據(jù)每一個(gè)被測(cè)者的4個(gè)位置的結(jié)果，得出檢測(cè)分析為：

1，未檢出突變：

您的檢測(cè)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)攜帶以上位點(diǎn)的突變；

2.檢出突變：

強(qiáng)烈建議您在醫(yī)生指導(dǎo)下禁止使用氨基糖苷類藥物。