[發明專利]用DCIK細胞培養的上清液及其應用

無效

• 申請號: 200810038429.4
• 申請日: 2008-06-02
• 公開（公告）號: CN101333515A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 陳宇光;石英俊
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K9/19;A61K35/12;A61P35/00
• 代理公司: 上海上大專利事務所（普通合伙）
• 代理人: 何文欣

技術領域

本發明涉及一種用DCIK細胞培養的上清液及其應用。

背景技術

當前臨床上惡性腫瘤的治療手段主要包括手術、化療和放療。近年來隨著生物醫藥的迅速發展，細胞免疫治療作為一種輔助療法已開始初步的臨床應用，并取得了一定療效。其中DCIK細胞就是新近報導的具有較好抗腫瘤效果的免疫效應細胞。

DCIK細胞是樹突狀細胞(DC)與細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)共培養獲得的效應細胞群，研究表明，DCIK效應細胞的增殖與細胞毒活性、抗原特異性等都比CIK細胞明顯增強。目前DCIK細胞已經在臨床II期試驗結果中取得了較好的療效，對常見腫瘤的治療效果顯著。

DCIK細胞由腫瘤患者外周血單個核細胞經誘導培養，再與自體誘導的DC共培養后而獲得，是經過腫瘤抗原沖擊誘導出的效應細胞，因而對腫瘤細胞具有特異性的攻擊能力。DCIK細胞在培養過程中，產生一系列的細胞因子并分泌于培養上清液中，這些細胞因子通過直接或間接的方式作用于腫瘤細胞，產生抗腫瘤活性。在相當復雜的體內環境中，多種細胞因子之間存在相互影響，產生細胞與靶細胞之間的相互作用，體液中的其它成分如激素、酶類等也影響其體內作用。也就是說各種細胞因子的作用并不是孤立存在的，它們之間通過合成分泌的相互調節、受體表達的相互調控、生物學效應的相互影響等復雜交互作用而組成細胞因子網絡(Cytokine?network)，并受到機體整體的調節。因此，單一細胞因子的臨床應用效果常常不能令人滿意，而細胞自然產生的混合細胞因子組合則可能取得出奇制勝的效果，當然在評價其生物學活性時，也應特別注重考察其體內實驗的結果。

至今多數研究僅關注一種或少數幾種細胞因子的臨床應用，但已開始出現混合細胞因子的臨床應用報導(CEL-SCI公司的Eyal·Talor)，他們采用PHA刺激人外周血單核細胞的方式培養收獲上清液()用于抗腫瘤應用，該混合細胞因子可改變腫瘤細胞的細胞周期，從而提高腫瘤細胞對放化療的敏感性。

目前，直接采用DCIK細胞來培養上清液的方法尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用DCIK細胞培養的上清液。該上清夜具有抑制腫瘤生長的作用。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用DCIK細胞培養的上清液，其特征在于該上清液是通過下列方法制備得到的，該方法的具體步驟為：DC與CIK細胞混合誘導第9天后，DCIK細胞進入大量擴增制備的階段；當培養液中的DCIK細胞濃度達到1～5×10⁶個/ml時，將混合均勻的DCIK細胞連同培養上清液一分為二，并另加入等體積的新鮮培養基，繼續培養；如此反復至第12-26天時，收集DCIK細胞培養的上清液。

一種上述的上清液的凍干粉的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：將上述DCIK培養的上清液，在4℃、4000rpm下離心20min，棄沉淀；于無菌條件下，-20℃預凍至上清液凝固；將凝固的上清液抽真空，升華干燥，除去冰晶；最后加塞加蓋進行密封。于-20℃保存凍干粉。

一種上述的上清液在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明采用本身具有抗腫瘤免疫效應的DCIK細胞進行培養，在培養過程中DCIK細胞分泌出的混合細胞因子具有靶向針對腫瘤細胞的直接或間接殺傷作用，作為潛在的一種抗腫瘤藥物，具有以下特點或優點：

1、該制品混合物中含有如穿孔素、顆粒酶和腫瘤壞死因子等，可以引起惡性腫瘤細胞破裂或凋亡，直接發揮抗腫瘤作用。

2、含有其它如IL-10、TGF等對機體免疫系統具有調節作用的因子，可以在體內相互協同作用，刺激自身體內具有腫瘤殺傷作用的免疫細胞增殖、成熟，從而間接發揮抗腫瘤作用，這一點對那些接受傳統放化療治療后骨髓抑制的病人具有重要意義。

3、由DCIK細胞所分泌的各種細胞因子量的配比是天然的，有理由推測這種配比可能與DCIK發揮強大的抗腫瘤作用相關，也可能是在體內發揮作用最適合的。

4、該混合細胞因子是人體DCIK細胞所分泌的天然因子，與臨床使用的重組細胞因子相比，具有天然構象，理論上活性更強。

5、該上清混合物應不會引起多藥耐藥性；同時，已經對化學藥物耐藥的腫瘤細胞應該仍對其殺傷作用保持敏感。

6、該制品與傳統放化療相比，副作用小，很少引起骨髓抑制等現象。

具體實施方式

1.DCIK細胞培養上清液的制備