[發明專利]一種抑制小鼠B7－DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法

無效

• 申請號: 200810036673.7
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101265478A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 江文正;樊燕;聞潔君;郝文麗
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/11
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 吳澤群

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體說，是涉及一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法。

背景技術

近年來大量的研究表明，T細胞的激活受正向和負向信號之間平衡的調節。T細胞上的共刺激或共抑制受體或配體與抗原提呈細胞上相應的配體或受體相互作用維持了這種平衡，并且最終決定T細胞的激活。B7-DC是共刺激分子B7家族的一個成員，近來被鑒定是免疫抑制性受體程序性死亡蛋白1(PD-1)的配體。B7-DC主要表達于單核細胞上，并在樹突狀細胞上呈選擇性表達。外周單核細胞經GM-CSF和IL-4誘導，產生的樹突狀細胞可高表達B7-DC。樹突狀細胞是目前功能最強的抗原提呈細胞，能夠起始和調節T細胞免疫。樹突狀細胞一旦激活后能夠表達大量的組織相容性復合體I類、II類分子，共刺激分子和粘附分子，這些分子為活化T細胞提供了第二信號。因此，人們日益關注用樹突狀細胞作為疫苗來治療慢性病毒感染和腫瘤。目前B7-DC對T細胞在體內的調節作用還不是完全清楚，但大量的研究表明B7-DC對T細胞反應具有負向調節作用。因此，抑制負向調節信號分子B7-DC可能會增強樹突狀細胞誘導的免疫應答的作用。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是指內源性或外源性雙鏈RNA(doublestrand?RNA，dsRNA)介導的細胞內mRNA發生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表型缺失。這一現象屬于轉錄后的基因沉默機制(Posttranscriptional?gene?silencing，PTGS)。研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段。在起始階段，加入的小分子RNA被切割成21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small?interfering?RNAs，siRNAs)。一個稱為Dicer的酶，是RNase?III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA，使目標mRNA不能翻譯，因而沉默。

作為研究基因功能的新工具，RNAi在細胞中具有抑制或滅活特異的基因的功能，可以產生類似基因“敲除”的效應，是功能基因組研究的有效工具，這一技術比基因敲除技術具有明顯投入少、周期短、操作簡單等優勢，它的應用為基因功能的研究開辟了新的途徑。siRNA獲取常用5種方法：(1)化學合成siRNA法；(2)體外轉錄siRNA法；(3)長片段dsRNA經RNase?III類酶的降解法；(4)siRNA表達載體或病毒載體在細胞內的表達；(5)使用PCR法制備的siRNA表達框在細胞中的表達法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，為研究B7-DC基因的功能、增強樹突狀細胞誘導的免疫應答中的應用研究提供一個有效工具。

本發明所提供的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，包括以下步驟：

A)根據Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，從編碼區中選取第361～379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG為靶序列，設計并合成引物，引物為：

siRNA1-Oligo1：5′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATCCTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′

siRNA1-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTTGAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′

siRNA2-Oligo1：5′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGAACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′

siRNA2-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTTGAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′；