[發明專利]一種抑制小鼠B7－DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法

無效

• 申請號: 200810036673.7
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101265478A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 江文正;樊燕;聞潔君;郝文麗
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/11
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 吳澤群

1.一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，其特征在于，其包括以下步驟：

A)根據Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，從編碼區中選取第361～379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG為靶序列，設計并合成引物，引物為：

siRNA1-Oligo1：5′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATCCTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′

siRNA1-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTTGAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′

siRNA2-Oligo1：5′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGAACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′

siRNA2-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTTGAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′；

B)將載體pAS經BgI?II、Hind?III雙酶切，用回收試劑盒回收；

C)siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火，即：用三蒸水稀釋引物至10μmol/μl，取siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2各1μl，加TE補至20μl，95℃5分鐘，70℃10分鐘，10℃20分鐘；

D)取5μl?siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火產物，加入1μl?pAS經BgI?II、Hind?III雙酶切回收后的產物，1μl?T4連接酶和2μl10×連接緩沖液，加雙蒸水補至20μl體系，置于4℃反應過夜；

E)將步驟D)所得的連接產物轉化至大腸桿菌DH5α，即：取連接產物20μl，加入200μlDH5α感受態細胞，冰浴30分鐘，42℃90秒，再冰浴2分鐘，加入800μlLB液體培養基，37℃、225rpm振搖60分鐘，取200μl菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上，37℃培養過夜；

F)挑取單個克隆菌落，置于3ml含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養基上，37℃培養過夜；

G)提取步驟F)獲得的菌液的質粒DNA；

H)所提質粒DNA經EcoR?I和Hind?III酶切鑒定，選出正確質粒，命名為shRNA1-B7-DC；

I)按照步驟A)至步驟H)的操作構建質粒shRNA2-B7-DC。

2.根據權利要求1所述的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，其特征在于，所述LB液體培養基的配方為：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉，用雙蒸水溶解至1000ml。

3.根據權利要求1所述的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，其特征在于，所述LB固體培養基的配方為：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉、15g瓊脂粉，用雙蒸水溶解至1000ml。

4.根據權利要求1所述的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，其特征在于，所述氨芐青霉素的濃度為100μg/ml。