[發明專利]一種DNA生物傳感器電極的制作方法及其應用

無效

• 申請號: 200810032800.6
• 申請日: 2008-01-18
• 公開（公告）號: CN101216451A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 藍閩波;張玲帆;左少華;滕淵潔;趙艷會;袁慧慧;趙紅莉;孟憲江
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王敏杰

技術領域

本發明涉及生物傳感器電極的制作方法及其應用，涉及利用電化學的方法檢測細菌DNA的生物傳感器的制備。

背景技術

食品衛生質量問題一直以來備受廣大人民的關注，大量食品中有害微生物的監測是食品安全檢測的重要一環。目前，一般檢測細菌的方法是通過測定細菌的生理、形態特征或通過測定細菌的基因組成來鑒定細菌。這些相關方法操作過程復雜，且需要花費很長的時間，它們已經遠遠不能滿足當前對微生物檢測的要求。近十年來，DNA生物傳感器出現，其具有快速、靈敏、操作方便、無污染等優點，在臨床基因診斷、環境分析和食品質量檢測等方面具有廣闊的應用前景。但是目前的DNA生物傳感器大多數是基于傳統的金電極，玻碳電極等，其成本高，處理較繁瑣，且不能一次性使用，很難得到應用和推廣。而基于絲網印刷電極研制的DNA生物傳感器克服了傳統方法耗時低效率的缺點，它是玻碳電極和碳糊電極的一種延伸，具有碳糊電極的電位窗口寬，背景電流低和廉價等優點，還具有能一次性使用，重復性好，可批量生產等特點。所以，利用絲網印刷電極制作一次性使用的DNA生物傳感器將是未來生物傳感器的一個主流，特別是在食品檢測等方面將有很大的發展潛力，隨著計算機技術、微制造技術和生物材料的不斷發展，DNA生物傳感器在食品檢測等領域的應用將越來越廣泛，它將取代現有的一些傳統的檢測方法，成為廣泛普及的常規儀器。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，探針DNA在絲網印刷碳電極上的固定方法，在此基礎上，設計了一種全新的絲網印刷碳電極，并在此種電極上通過電沉積的方法修飾了氧化鋯薄膜，制備了一種一次性使用的DNA雜交生物傳感器。

本發明涉及一種一次性使用的DNA生物傳感器電極的制作方法，其步驟如下：

首先，利用絲網印刷方法獲得具有導電層、碳層和絕緣層的碳電極，該碳電極經含Zr離子的電解液修飾后得到ZrO₂/SPE電極；

然后，選擇待測對象的特征DNA序列，設計其作為探針的互補ssDNA序列和完全不互補ssDNA序列，在探針ssDNA的5’端修飾磷酸基團，通過人工合成獲得，將所得的ssDNA溶于pH值為6.0～9.0的緩沖溶液中，在-20℃下保存；按需求將ssDNA的緩沖溶液稀釋到所需濃度，用微量吸管吸取少量的探針ssDNA到ZrO₂/SPE電極上，利用ZrO₂/SPE電極表面的氧化鋯薄膜與探針ssDNA的5’端的磷酸基團特異性結合，從而把探針固定到ZrO₂/SPE電極表面，即得ssDNA/ZrO₂/SPE生物傳感器。

所述碳電極的制備包括如下步驟：

a)底板的選擇和處理：選用PVC或PP薄板作為電極的底板，先用有機溶劑擦洗底板表面，再用雙蒸水沖洗待用；

b)導電層的印刷：利用絲網印刷機在待用底板的表面印刷一層導電銀條，干燥后形成導電層；

c)碳層的印刷：利用絲網印刷機在b)的基礎上再印刷一層碳層，干燥后待用；

d)絕緣層的印刷：利用絲網印刷機在c)的基礎上再印刷一層絕緣層，干燥后最終形成絲網印刷碳電極；

e)絲網印刷碳電極的修飾：以上述絲網印刷碳電極作為工作電極，以飽和甘汞電極作為參比電極，以鉑絲作為對電極，組成三電極系統；選用0.1M?KCl，3～10mM?ZrOCl₂作為電解液，在-1.1V～+0.7V(vs.SCE)電壓范圍內，掃描速率為0.2～0.5mV/s，掃描時間為15min～30min，對三電極系統進行循環伏安掃描，得到氧化鋯薄膜修飾的ZrO₂/SPE電極。

所述碳層是圓形或方形。

所述DNA生物傳感器電極的應用，其特征在于，使所述DNA生物傳感器電極與一定濃度的待測對象的特征ssDNA的緩沖溶液進行雜交反應，形成dsDNA/ZrO₂/SPE，雜交時間為數十分鐘；同樣使ssDNA/ZrO₂/SPE與一定濃度的完全不互補的ssDNA的緩沖溶液進行反應，形成ncDNA/ZrO₂/SPE；雜交前后的傳感器浸入到含有20μM的亞甲基藍指示劑的緩沖溶液中，溶液中具有氧化還原活性的亞甲基藍將和DNA作用，且在傳感器上發生電化學反應，于微分脈沖伏安圖上0V～-0.5V區間呈一良好的還原峰，測量峰電流的變化，通過比較，根據峰電流變化大小來對待測DNA進行定性和定量。