[發明專利]基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200810028441.7
• 申請日: 2008-05-30
• 公開（公告）號: CN101302553A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 曹以誠;石磊;杜正平;陳洵;趙長臣;譚惠媚;劉妙琴;李心暉
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術

目前對結核分歧桿菌有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒定、形態學鑒定和自動生化鑒定為主的國家標準(GB/T4789.7-2003)，到特異蛋白的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應(PCR)技術等分子生物學檢測方法[食品安全檢測與現代生物技術，化學工業出版社，2004年]。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術試圖突破傳統的形態學、生化反應等微生物學檢測舊模式，不需要對微生物進行分離提純，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產物進行快速檢測，并且與分子生物學技術及生物信息學手段相結合，向準確、快速、靈敏和自動化的方向發展。

以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實際應用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(real?time?PCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此不適用于現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫擴增(Isothermal?Amplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術(LAMP)具有很多的優越性，且目前也未見有用環介導等溫擴增技術檢測結核分歧桿菌的基因快速診斷試劑盒。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測成本低、使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒，該試劑盒是基于環介導等溫擴增技術來檢測結核分歧桿菌的。

本發明的另一個目的是提供上述結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒的檢測方法。

本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的：

一、本發明的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、Bst?DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中，其中：

所述兩對引物為：

外引物F3：GGCTGGTCTCTGGCGTT，如SEQ?ID?NO：1所示；

外引物B3：GGCCTATACAAGACCGAGCT，如SEQ?ID?NO：2所示；

內引物FIP：GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT，如SEQ?ID?NO：3所示；

內引物BIP：GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT，如SEQ?ID?NO：4所示；

上述反應液每1L中含有1.6～2mmol?dNTP、20～25mmol?Tris-Cl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～10mmol硫酸鎂、1～1.25ml?TritonX-100、0.8～1mol甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol。優選的比例是：每1L中含有2mmol?dNTP、25mmol?Tris-Cl、12.5mmol氯化鉀、12.5mmol硫酸銨、10mmol硫酸鎂、1.25ml?TritonX-100、1mol甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol。

上述裂解液1每1L中含有10～20mmol?pH8.3的Tris-HCl、50～100mmol?KCl、2.5～5mmol?MgCl₂、5～10ml?Triton?X-100、5～10ml吐溫-20和0.1～0.2g明膠。

上述裂解液2為蛋白酶K。

上述陽性對照為結核分歧桿菌基因組DNA。

上述顯色液優選為SYBR?Green?I或EvaGreen。

上述穩定液優選為石蠟油。

二、本發明基因快速診斷試劑盒的生產工藝

1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質檢；