[發明專利]從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒及其方法

有效

• 申請號: 200810027305.6
• 申請日: 2008-04-09
• 公開（公告）號: CN101250521A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 黃暉;董志軍;黃良民;李元超
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責任公司
• 代理人: 余炳和

技術領域

本發明涉及一種從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒及使用該試劑盒提取造礁石珊瑚共生蟲黃藻基因組DNA的方法。

背景技術

珊瑚礁具有極高的生物多樣性，全世界海洋生物中有25％生活在珊瑚礁，有“海洋綠洲”或“海洋熱帶雨林”之稱，其社會經濟價值不可估量。珊瑚礁生態系統具有極豐富的生物資源，是漁業的繁殖基地，為人類提供重要的食物和藥物資源；海底的珊瑚礁，風景秀麗，更是有名的海底花園，是人們極好的潛水旅游圣地。因此珊瑚礁的保護和可持續利用日益引起人們的關注，例如我國目前已經成立海南三亞珊瑚礁國家自然保護區和廣東徐聞珊瑚礁國家自然保護區，由科研人員或者海洋保護管理部門工作人員對珊瑚礁生態系統進行定期的監測。由于全球變暖引起的珊瑚白化直接威脅珊瑚礁生態系統的生存和發展，其中與造礁石珊瑚共生的蟲黃藻的種類和多樣性直接影響到宿主石珊瑚能否抵御外界環境的變化，因此珊瑚礁保護區的常規監測不僅需要掌握造礁石珊瑚的群落種類變化，與其共生的蟲黃藻的種類和多樣性同樣也需要監測，由于培養蟲黃藻的技術不成熟以及不同生命周期的蟲黃藻形態學特征不完全一致，以及蟲黃藻因長期適應于共生關系的情形下常會失掉很多的外在特征，因此運用傳統的形態學方法識別與造礁石珊瑚共生的蟲黃藻的種類和多樣性有其局限性。考慮到監測人員(包括科研人員和海洋保護管理部門工作人員)能夠便捷及快速的進行監測，分子生物學技術的運用無疑是最恰當的手段。

利用分子生物學技術對蟲黃藻進行種類鑒定首先要能提取到高質量的蟲黃藻基因組DNA。由于蟲黃藻共生于造礁石珊瑚體內，而造礁石珊瑚本身具有碳酸鈣的骨骼，提取過程中碳酸鈣鹽會對基因組DNA片段造成機械剪切，從而為提取高質量的蟲黃藻基因組DNA增加了困難。而常規的酚/氯仿提取方法，由于方法繁瑣，并且具有有機溶劑的毒性，不適于常規檢測的運用。因此需要研制一種簡易的從造礁石珊瑚中提取蟲黃藻基因組DNA的方法，以滿足珊瑚礁保護區常規監測任務的需要。

發明內容

本發明目的是提供一種能從造礁石珊瑚中快速、高效提取蟲黃藻基因組DNA的試劑盒及使用該試劑盒提取造礁石珊瑚共生蟲黃藻基因組DNA的方法，用于解決珊瑚礁保護區常規監測中利用分子生物學技術識別與造礁石珊瑚共生的蟲黃藻的種類和多樣性的監測任務，為珊瑚礁保護區的保護和管理提供技術支持。

本發明所提供的蟲黃藻DNA提取試劑盒，包含有以下試劑：

(a)試劑A：由pH8.0，100-300mM的Tris-Boric溶液、10-100mM的EDTA溶液、質量濃度1-5％的SDS溶液、50-200mM的NaCl溶液和蒸餾水按25∶10∶10∶2∶53的體積比混合而成；

(b)試劑B：為蛋白酶E，其濃度為5-15mg/ml；

(c)試劑C：為RNAase?A，其濃度為5-30mg/ml；

(d)試劑D：為過飽和NaCl溶液，含有5-7M的NaCl；

(e)試劑E：為DNA洗滌液，為體積濃度為60-80％的乙醇溶液；

(f)試劑F：為DNA洗脫液，采用pH8.0，5-20mM的TE緩沖液。

本發明優選的試劑盒的配方如下：

(a)試劑A：由pH8.0，250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、質量濃度2％的SDS溶液、100mM的NaCl溶液和蒸餾水按25∶10∶10∶2∶53的體積比混合而成；

(b)試劑B：為蛋白酶E，其濃度為10mg/ml；

(c)試劑C：為RNAase?A，其濃度為20mg/ml；

(d)試劑D：為過飽和NaCl溶液，含有7M的NaCl；

(e)試劑E：為DNA洗滌液，為體積濃度為75％的乙醇溶液；

(f)試劑F：為DNA洗脫液，采用pH8.0，10mM的TE緩沖液。

在本試劑盒里，試劑A在高溫(55-65℃)下可裂解細胞，使蛋白變性、染色體離析。試劑B主要水解消化蛋白質。試劑C則用于降解RNA，防止RNA對下游操作造成干擾。試劑D為過飽和NaCl溶液，在高濃度NaCl低PH下，DNA可以與硅膠結合。試劑E用以清洗掉DNA以外的成分，在一定濃度的乙醇存在下，沖洗過程中，DNA不會溶失。試劑F提供低鹽穩定PH環境，用以洗脫DNA。