[發明專利]用于骨質疏松癥的RNA干擾載體及大鼠骨髓間質干細胞

無效

• 申請號: 200810027297.5
• 申請日: 2008-04-09
• 公開（公告）號: CN101555487A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 張麗蓉
• 申請（專利權）人: 廣東藥學院
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/11;C12N5/10;A61K48/00;A61P19/10
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種下調PPARγ表達的shRNA慢病毒表達載體以及將該載體轉入大鼠骨髓間質干細胞后形成的基因修飾的骨髓間質干細胞。

背景技術

骨質疏松癥(osteoporosis)是以骨量減少，骨組織顯微結構退化為特征，從而導致骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身性骨代謝異常疾病。引起骨質疏松的原因很多，例如年齡的增加、長期使用糖皮質激素等，目前尚無理想的治療方法。隨著人均壽命的延長，骨質疏松癥的發病率增加所造成的危害日趨嚴重，尋找有效的治療方法迫在眉睫。

骨髓中除了造血系統外，還含有骨髓基質成分，主要包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌肉細胞等。成骨細胞的主要作用是合成和礦物化細胞外基質，脂肪占了正常骨髓空間的50％，它可以為骨髓中其它細胞的分化和發揮功能提供必需的能量，隨著年齡的增長，骨髓中的脂肪細胞逐漸增加，最多可占骨髓的90％。臨床研究發現，增齡、卵巢切除、糖皮質激素等原因引起的骨質疏松均存在脂肪組織增加和骨質減少的現象。

眾所周知，骨髓腔中的成骨細胞與脂肪細胞均來源于骨髓間質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSC)，MSC分化方向的改變，致使成骨細胞減少，脂肪細胞增加可能是骨質疏松的發病原因之一。

本發明人的研究發現，MSC在不同誘導條件下可向成骨細胞或脂肪細胞分化，調控信號傳導途徑可逆轉MSC向成骨細胞或脂肪細胞的分化命運(張麗蓉，項鵬，李樹濃等。PD98059對人骨髓間質干細胞分化為成骨細胞的影響。中國病理生理雜志，2002，18(8)：896-899)。分化方向的不同歸根結底是通過胞內的信號傳導途徑激活的一系列不同的轉錄因子來實現，其中與成骨和成脂相關的轉錄因子就是過氧化物酶體增殖子激活受體γ(PPARγ)。

過氧化物酶體增殖子激活受體γ(peroxisome?proliferator-activatedreceptor，PPARγ)是核激素受體超家族成員，它與胞內配體結合后起轉錄因子作用。PPARγ2亞型在白色和褐色脂肪組織中高度表達并在脂肪細胞的分化中起重要的調控作用，研究發現，PPARγ2對骨髓間質干細胞的分化方向起關鍵的調控作用，在成骨與成脂過程中起到分子開關的作用。骨髓腔中的成骨細胞和脂肪細胞均來源于MSC，且數量存在此消彼長的關系，PPARγ介導MSC成脂分化因而可直接影響成骨細胞的分化，這可能是骨質疏松時骨髓中脂肪細胞與成骨細胞比例失調的一個原因。

作為成骨細胞和脂肪細胞的前體細胞，MSC具有取材方便、擴增迅速、低免疫原性、選擇性歸巢回骨髓、易于外源基因轉染與表達等特點，因此選擇它作為骨質疏松癥的細胞治療或基因治療的靶細胞具有得天獨厚的條件。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于骨質疏松癥的RNA干擾載體。

針對MSC具有向脂肪細胞和成骨細胞雙向分化的特點以及PPARγ在成骨與成脂分化過程中的關鍵作用，如果能夠調控MSC內PPARγ的表達(抑制PPARγ的表達)，則可促進MSC向成骨方向分化，抑制其向脂肪細胞分化。本發明采用RNA干擾技術來實現這一目的。RNA干擾技術是通過小的干擾RNA片段以序列特異的方式下調基因的表達。

本發明所述的一種用于骨質疏松癥的RNA干擾載體，其特征在于：在基于慢病毒的短鏈發夾RNA表達的骨架質粒中，引入以過氧化物酶體增殖子激活受體γ即PPAR?γ為作用靶點的可表達出短鏈發夾RNA即shRNA的DNA片段，構建為慢病毒表達載體(lentiviral?expression?vector)；該質粒含有U6啟動子，該啟動子是DNA依賴的RNA聚合酶，通過XhoI和HpaI兩個酶切位點在U6啟動子后引入可表達出短鏈發夾RNA的DNA片段，該DNA片段的雙鏈序列分別為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2，以便在U6啟動子作用下表達短鏈發夾RNA；并且，在插入DNA片段的下游是CMV(巨細胞病毒)啟動子控制的GFP(綠色熒光蛋白)基因，由于短鏈發夾RNA與GFP共表達，以致可通過檢測GFP的表達以方便觀察短鏈發夾RNA表達的情況；所構建的RNA干擾載體可表達針對PPARγ的特異性短鏈發夾RNA，從而下調PPARγ的表達。

本發明還提供了用上述的RNA干擾載體轉染的大鼠骨髓間質干細胞。