[發明專利]一種制備脫細胞基質的方法

有效

• 申請號: 200810026972.2
• 申請日: 2008-03-24
• 公開（公告）號: CN101274106A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 王智崇;陳冬;武征
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 莫瑤江;萬志香

技術領域

本發明屬于組織工程領域，具體地說是涉及一種制備脫細胞基質的方法。

背景技術

來源于脫細胞基質的各種生物支架材料，在動物實驗的臨床前研究和人種疾病的臨床應用中，已經取得了成功。通過去除各種組織器官中異種或同種異體細胞，保留其中復雜的結構和功能蛋白，即可得到相應組織器官的脫細胞基質。不同的脫細胞方法直接影響所得脫細胞基質的成分和超微結構，最終影響移植后宿主對脫細胞基質的反應。

現行脫細胞基質的制備方法主要包括：1物理法；2化學法；3酶法。物理法指的是通過冷凍，高壓，超聲波，滲透壓改變等物理方式破壞細胞，其優點在于得到的脫細胞基質沒有其他外加成分的殘留，但這種方法的最大缺點是：在破壞細胞的同時也不同程度的破壞了細胞外基質的超微結構，同時破裂的細胞碎片一定要通過其他方式予以清除，這種清除過程會進一步破壞細胞外基質的超微結構。化學法包括使用某些酸、堿、表面活性劑等化學方法裂解細胞。這種方法其優點在于脫細胞過程短，速度快，但這種方法同樣會破壞細胞外基質的超微結構，并且還會造成某些基質成分(如蛋白多糖)的丟失。酶法主要使用各種蛋白酶(如胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸內切酶)，通過水解細胞蛋白成分和核酸成分達到破壞細胞的目的。蛋白酶可以有效地去除細胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶的作用底物比較廣泛，造成細胞外基質中的結構和功能蛋白大量降解。核酸酶選擇性的降解核酸，不會造成細胞外基質成分的破壞，但其分子量過大，極易引起免疫反應。

在組織工程中良好的支架材料應具有以下技術要求：①良好的生物相容性，自身及其降解產物對機體無毒性，不引起排斥反應和炎性反應，不致突變、畸變；②材料攜帶具有生物誘導性的多種細胞生長因子，誘導自體細胞生長繁殖；③支架材料的降解速率與植入脫細胞基質的細胞形成組織器官的速率相匹配。在支架完成其功能后可被完全吸收或與新生的組織融合；④可按各組織的特點和缺損情況進行塑形，達到完善修復；⑤具有一定的韌性和可加工性，能形成三維立體結構，為細胞進行物質代謝提供足夠空間?，F有研究表明利用脫細胞基質作為組織工程的支架材料具有來源廣泛，可降解，有良好的生物相容性的特點，特別是材料可預先按修復組織大小和厚薄設計，更適于各種組織病變的修復重建。因此，如何獲得具有以上5項技術要求的脫細胞基質成為組織工程亟待解決的重大課題。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供一種制備脫細胞基質的方法，該方法可制備到具有較好物理學性狀和生物學功能的脫細胞基質。

解決上述技術問題的技術方案如下：

一種制備脫細胞基質的方法，包括以下步驟：

a.將待用組織器官預處理；

b.將經過預處理的待用組織器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，通過低滲或等滲液浸泡制備脫細胞基質，其中，磷脂酶的濃度小于10000U/ml；

c.洗滌制備的脫細胞基質

本發明一種利用磷脂酶制備脫細胞基質的方法的技術方案是選擇專一性更強的包含有磷脂酶的溶液特異性水解待用組織器官中細胞的磷脂成分，達到脫去細胞而不損傷細胞外基質的目的。同時也可以輔以化學法，使用對細胞外基質成分影響很小的一種或一種以上表面活性劑，以加快磷脂酶的脫細胞作用。另外，根據各種組織的脫細胞要求的不同，可以再輔以物理方法進一步加快磷脂酶的脫細胞速度。

所述的待用組織器官包含有異種或同種異體或自體組織器官?？蔀槠つw，心瓣膜、血管、膀胱、韌帶、軟骨、神經中的任一種，也可以為角膜、鞏膜、結膜中的任一種或其任意組合體。

所述的預處理指的是使用包含抗生素的生理緩沖液對待用組織器官進行常規清洗、消毒、分離。還可以包括低滲或等滲浸泡，震蕩，調節洗滌溫度，適當頻率和強度的超聲波處理

所述的磷脂酶包含有磷脂酶A₁，A₂，B₁，B₂，C，D中的任一種或一種以上。。

所述的磷脂酶的濃度范圍小于10000U/ml，優選1-1000U/ml。含有磷脂酶溶液的溫度范圍為0-56℃，含有磷脂酶溶液的pH值范圍為5-12。

在利用低滲或等滲浸泡，震蕩時，可以調節反應溫度，適當頻率和強度的超聲波處理等物理方法進一步加快磷脂酶的脫細胞速度。

所述的表面活性劑指的是生物體內可以生成的具有表面活性作用的成分，或指的是人體內可以生成的具有表面活性作用的成分。