[發(fā)明專利]一種地衣芽孢桿菌及其利用污泥為原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810026812.8
• 申請(qǐng)日: 2008-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN101245327A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周順桂;王躍強(qiáng);雷發(fā)懋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/56;C12R1/10
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及新菌種篩選以及酶制劑生產(chǎn)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種地衣芽孢桿菌及其利用城市污泥作為發(fā)酵原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。

背景技術(shù)

城市污泥是污水處理過程中產(chǎn)生的沉淀物，含有大量的有機(jī)物、豐富的氮磷等物質(zhì)以及病原菌等，是重要的環(huán)境污染源。目前，我國(guó)城市污泥年產(chǎn)生量約800萬噸干重，并且隨著污水處理廠的增加和污水處理率的提高，產(chǎn)生量將日益龐大。如何妥善地處置污水廠污泥，防止其二次污染，并將其作為一種有用資源加以利用，變廢為寶，具有十分重要的意義。

目前，城市污泥的處置途徑主要有：填埋、焚燒和土地利用等。但它們都存在著各自難以克服的弱點(diǎn)。事實(shí)上，污泥中含有大量的有機(jī)質(zhì)和豐富的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，可以滿足微生物生長(zhǎng)和增殖的需要。據(jù)檢索，已有利用城市污泥為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物農(nóng)藥、生物氫與乳酸等的報(bào)道。

堿性蛋白酶是目前世界上最重要的工業(yè)酶制劑，主要用于加酶洗滌劑工業(yè)，在制革、絲綢、飼料、醫(yī)藥與環(huán)保等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，其產(chǎn)量約占整個(gè)酶制劑的25％。堿性蛋白酶主要生產(chǎn)方式是微生物發(fā)酵，主要生產(chǎn)菌株是短小芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌。

目前，堿性蛋白酶的主流生產(chǎn)工藝為液體深層發(fā)酵，一般采用黃豆粉、淀粉、礦物質(zhì)等作為發(fā)酵原料，這些原料價(jià)格昂貴，導(dǎo)致產(chǎn)品價(jià)格較高。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)利用城市污泥為發(fā)酵原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，而提供一種適于城市污泥發(fā)酵的堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株-地衣芽孢桿菌。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述地衣芽孢桿菌，以污泥為原料生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。

本發(fā)明所得菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)HM-3，為革蘭氏陽性菌，直桿狀，分離于廣州市獵德污水處理廠的濃縮污泥。2007年3月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為：CGMCC?1970。

g/L是指每1L培養(yǎng)基液體中加入的目標(biāo)物的克數(shù)；

％是指每100份質(zhì)量的培養(yǎng)基液體中接入接種物的質(zhì)量份數(shù)；

一.本發(fā)明所得地衣芽孢桿菌由如下方法篩選得到：

稱取10克濃縮污泥放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)有玻璃珠)，28℃、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)15分鐘，無菌水稀釋到適當(dāng)濃度，吸取0.1mL稀釋液均勻涂布于干酪素培養(yǎng)基平板，28℃恒溫箱培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，在培養(yǎng)基平板上均勻涂布三氯乙酸溶液，挑取有明顯水解圈的菌落在干酪素平板反復(fù)培養(yǎng)并驗(yàn)證，并進(jìn)行分離純化與保存。所用干酪素培養(yǎng)基成分為：干酪素20g，瓊脂粉20g，pH?9.0，蒸餾水1L。此培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，用于堿性蛋白酶菌株的篩選。所用斜面保藏培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，成分為(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl?10g，pH?7.4，蒸餾水1L，用于斜面菌種的保藏。

二.本發(fā)明菌株具有如下形態(tài)和生理、生化特性：

1.形態(tài)特征

地衣芽孢桿菌HM-3菌體短小、直桿狀，寬0.1-0.3μm，長(zhǎng)0.5-1.0μm；菌落為乳白色、疏松、易挑取，不透明，表面粗糙，邊緣不整齊。芽孢端生，形狀橢圓或柱狀，芽孢囊無明顯膨大。

2.生理生化特性

B.licheniformis?HM-3嚴(yán)格好氧，具有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏反應(yīng)陽性，M.R和V.P反應(yīng)陽性，能水解淀粉，液化明膠；能產(chǎn)生蛋白酶，可利用丙二酸鹽，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。經(jīng)BIOLOG微生物鑒定儀鑒定為地衣芽孢桿菌。

三、本發(fā)明菌株以城市污泥培養(yǎng)基為發(fā)酵原料生產(chǎn)堿性蛋白酶，步驟如下：

(1)培養(yǎng)基調(diào)理：調(diào)節(jié)污泥含固率為2～5％，加入0.1～0.3％泡敵，用酸或堿調(diào)pH為7.0～7.5，攪拌均勻，滅菌，冷卻備用；

(2)搖瓶培養(yǎng)：挑取一環(huán)地衣芽孢桿菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基中，28～32℃、50～250轉(zhuǎn)/分進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)10～15小時(shí)；

(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：按1～5％的接種量將搖瓶菌液移入裝有含固率為2～5％的污泥的發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

(4)蛋白酶純化：發(fā)酵完成后，調(diào)pH為6.0～7.0，濃縮制成液體劑型或凝聚、過濾制成堿性蛋白酶固體劑型；

(5)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)：產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)方法參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《洗滌劑用堿性蛋白酶制劑》(QB?1806-1993)進(jìn)行。

在上述方法中，步驟(1)所述滅菌優(yōu)選為在0.1KPa壓力與121℃下滅菌45分鐘。