[發明專利]結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法

有效

• 申請號: 200810025758.5
• 申請日: 2008-01-11
• 公開（公告）號: CN101481701A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 夏坤;佟順剛
• 申請（專利權）人: 廣州天寶頌原生物科技開發有限公司
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/31;C12N15/52;C12N15/70;C07K14/405
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司
• 代理人: 劉 媖

技術領域

本發明屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種結合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質的制備方法。

背景技術

藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發射約640nm的熒光；APC吸收約650～660nm的可見光，發射約660～670nm的熒光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB)；PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB)；PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB)；CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。

PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley?AJ，Glazer?AN.Biosynthesis?of?the?cyanobacterial?light-harvesting?polypeptide?phycoerythrocyanin?holo-alphasubunit?in?a?heterologous?host.J?Bacteriol.2002；184(17)：4666～4671)。與前人的方法不同，我們發現Anabaena?sp.PCC7120中all5339基因編碼beta155裂合酶，在其它藍藻中也存在同源的beta155裂合酶。這類beta155裂合酶不僅能催化藻藍膽素PCB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成藻紅藍蛋白類熒光蛋白質，還能催化藻紅膽素PEB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成一種新型的結合了PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質。藻紅膽素PEB可由HO1、PebA、PebB協同催化生成(Alvey，R.M.，Karty，J.A.etc.Lesions?inPhycoerythrin?Chromophore?Biosynthesis?in?Fremyella?diplosiphon?Reveal?Coordinated?LightRegulation?of?Apoprotein?and?Pigment?Biosynthetic?Enzyme?Gene?Expression.Plant?Cell?15(10)，2448-2463(2003))。在絕大部分的藍藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有異形胞的藍藻中存在PEC；隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基因。

藻膽蛋白類熒光蛋白質可以應用于食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。目前使用的藻膽蛋白類熒光蛋白質主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723，2002.04.17。一種水華藍藻制備藻藍蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12)。本方法不利用藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產新型的藻紅藍蛋白。藻紅藍蛋白類熒光蛋白質具有優良的熒光性質，這種結合PEB的新型藻紅藍蛋白，為開發新型熒光探針提供了更多的選擇。本方法為藻紅藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用于食品、化妝品、醫藥和生物工程領域奠定了基礎。

發明內容