[發明專利]重組腫瘤抑素－腫瘤壞死因子分泌型真核表達載體及其制備方法和用途

無效

• 申請號: 200810025044.4
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101265482A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 羅以勤;趙亮;姚麗娟
• 申請（專利權）人: 羅以勤;趙亮;姚麗娟
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/62;C07K19/00;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司
• 代理人: 吳啟運

一、技術領域

本發明涉及醫藥生物技術領域的基因克隆、基因重組、外源基因在真核細胞中的分泌表達，特別涉及用基因工程制備融合蛋白腫瘤抑素-腫瘤壞死因子的方法，其中包括融合蛋白的分泌型真核表達載體，含該載體的宿主細胞，以及該融合蛋白的一些生物活性研究。

二、背景技術

化療、放療及生物治療等傳統治療都是針對腫瘤細胞本身。然而，實體瘤不同于血液系統腫瘤，必須通過血管從宿主獲取營養。實體腫瘤的生成依賴于腫瘤本身新生血管的形成，腫瘤血管的再生受到眾多血管刺激及抑制因子的調控。隨著腫瘤血管再生理論和相應基礎臨床研究的快速進展，抗腫瘤血管生成治療已成為腫瘤綜合治療中的一項重要內容。人工已能提取血管抑素、腫瘤抑素等血管生長抑制因子用于臨床治療研究。

20世紀70年代，美國學者Folkman提出了腫瘤生長是依賴血管的。這為靶向血管的抗腫瘤研究奠定了堅實的基礎。實體瘤的發展分為無血管期和血管期，絕大多數人體腫瘤位于原發部位數月到數年處于無血管狀態，在無血管階段，腫瘤組織極少超過2～3mm。腫瘤組織內一旦某亞群細胞轉化到促血管生成表型，就開始血管形成。血管形成過程是復雜的，它需要內皮組織、有絲分裂、管道形成和基底膜的形成。血管形成過程受到血管形成因子和抑制因子的調節。血管形成狀態則表明血管形成因子和抑制因子二者的平衡狀態被打破。實體腫瘤生長必須依賴持續和廣泛的血管生成(Angiogenesis)，腫瘤細胞聚集團從宿主基質中建立自身的血液供應系統，已長成的瘤體從宿主中獲取新的血管成分亦屬同樣的過程。

正常生理狀態下，血管的生成和抑制因子對血管內皮新生的調節處于一種動態的平衡，血管生成機制處于“關閉”狀態。病理狀態下，血管的生成和抑制因子的共同作用處于失平衡狀態。腫瘤從血管前期的靜止狀態發展到伴隨腫瘤血管新生的浸潤狀態，需要突破這些刺激因子和抑制因子作用的平衡。當腫瘤組織內的血管生成刺激因子作用處于上調狀態，血管生成抑制因子作用處于下調狀態，血管生成作用機制則處于“開啟”狀態，即出現腫瘤血管新生。這就是所謂的血管形成的開關平衡假說。病理狀態下新生的血管是混亂無序排列的，新生血管壁不完整，存在大量裂隙。這是因為平滑肌、外膜細胞不能完整形成和排列所致。血管再生影響腫瘤的生長和轉移特性。這是因為新生血管是提供病理組織養分保證其生長增殖的基礎，同時，腫瘤新生的血管使得腫瘤細胞與個體的血管循環系統直接相通，這也是惡性腫瘤發生遠處轉移播散的必要條件，腫瘤血管的新生數量可以用以判斷腫瘤患者的預后。

抗血管生成方法，既然腫瘤血管形成與腫瘤的生長和轉移關系如此密切，抗腫瘤血管生成的方法自然可以起到抗癌的作用。這一方法已被越來越多的實驗證明是可行的，抗血管的生成的可以在5個不同的水平起作用：①阻止腫瘤細胞分泌腫瘤血管生成因子(Tumorangiogenesis?factors，TAFs)；②阻斷TAFs的效應，即通過抗TAFs抗體或抗TAFs受體的抗體來中和或阻斷其生物學效應；③抗內皮細胞增殖及遷徙；④干擾內皮細胞與細胞外基質(EMC)的相互作用，阻止血管網的形成；⑤抑制血管平滑肌細胞的生長。有關抗TAFs抗體中和作用抗血管生成的研究較多，Gross等利用人結腸癌裸鼠體內移植模型研究發現，應用bFGF可使腫瘤生長加快，血管密度增加，若同時使用抗bFGF單抗則可阻止腫瘤在裸鼠體內的生長，抗VEGF抗體亦有同樣的效果。這一方法的問題在于，腫瘤細胞可以分泌一系列TAFs，僅僅抑制個別因子可能難以達到理想的抗癌效果。抗血管生成的另一個途徑是抗內皮細胞的增殖和遷徙，血小板因子-4，煙曲霉素和人泌乳素16kD片段均可抗生長因子刺激的內皮細胞增殖，凝血栓蛋白(Thrombospondin)、魚精蛋白和硫酸甲殼素均有抗內皮細胞移動的作用。體外實驗證明了這一點。

抑制血管生長的藥物種類：1.抗體類：中和VEGF的單克隆抗體、抗新生血管內皮細胞的單克隆抗體及其基因工程抗體、抗整合素抗體等導致血管內皮細胞凋亡，破壞新生血管的形成，使腫瘤消退和預防轉移，特別對晚期患者，已在乳腺癌、結腸癌、肺癌及黑色素瘤中得到證實。2.基因重組類：血管抑制素、內皮抑制素、重組IL-12、干擾素-α2a等。3.化學合成或提取類：防止基底膜降解的Marimastat與Bartimastat合成的非蛋白制劑、煙曲霉素及其衍生物、戊聚糖(PPS)、蘇拉明、、甲基吡啶酸(picolimic?acid)等。