[發明專利]反映心肌微小損傷情況的外周血cTnI基因檢測方法

無效

• 申請號: 200810025042.5
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101294219A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 朱健華;姚登福;吳瑋
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南通市永通專利事務所
• 代理人: 葛雷

技術領域：

本發明涉及一種外周血cTnI基因檢測方法。

背景技術：

心臟主要是由含有豐富的肌原纖維、具有收縮泵血功能的工作細胞構成。心肌細胞連接緊密，靠特殊的閏盤結構形成一個機能復合體。心肌不停地做功，氧需求量大，因而對各種損傷因素比較敏感。心肌損傷發生后，出現細胞損傷壞死的一般病理變化過程，即細胞膜通透性的增加、胞漿內容物的釋放、細胞核的固縮和溶解，由于心肌細胞結構的特殊性，心肌細胞損傷后不會或極少以完整的細胞脫落到外周血。心肌損傷標志物研究雖不斷深入，新的心肌損傷標志物還包括一些粘附分子，如可溶性P選擇素及細胞粘附分子(CAM)、細胞內粘附分子(ICAM)、血管粘附分子(VCAM)和腦型鈉尿激素(BNP)，但尚未有理想的能夠取代cTnI的標志物。cTnI因其分子量小，釋放入血時間短，與骨骼肌無交叉反應，被廣泛應用于臨床，cTnI目前主要應用于ACS，在其他可引起cTnI輕度到中度升高的心臟疾病如心肌炎，心力衰竭的應用方面尚缺深入研究，有望cTnI檢測的標準化問題解決后，對cTnI的認識會更加完善，cTnI取代傳統酶學檢測應是大勢所趨。隨著新的更具特異性的心肌損傷標志物被認識、檢測方法的簡單化和標準化，嚴重威脅人們身心健康的心臟疾病會得到早期診斷和早期治療。心血管疾病以其發病率高、變化快、死亡率高而嚴重威脅著人類的身心健康。歐美國家心血管疾病占總發病率的第一位，在美國約800萬人患病，每年約50萬人死于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。我國心血管疾病的發病率亦呈明顯上升趨勢，其死亡率數十年來一直占人口總死亡率的首位。在心血管疾病的早期診斷、心肌損傷的程度、鑒別診斷、療效評價、預后估計等方面，心肌損傷標志物分析的臨床價值已被公認，且在心肌的非侵入性監測、對于輔助臨床診斷和指導治療起重要作用。早期發現和診斷心肌損傷對于臨床正確治療和護理病人極為重要。心肌損傷的診斷主要依賴特異性高的酶學標志與心肌肌鈣蛋白I(cTnI)分析。病毒性心肌損傷模型研究，發現cTnI變化在心肌損傷發展期逐漸上升，在好轉期逐漸回復至正常水平，其水平與心肌損傷程度及預后密切關系已被證實是目前較為理想的心肌損傷標志物。但酶學及cTnI在慢性心肌病患者或存在微小心肌損傷時不夠敏感，另外心肌損傷過程中cTnI-mRNA的表達規律尚不清楚。本法建立逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析組織與血cTnI-mRNA，用于臨床發現外周血cTnI-mRNA為靈敏的基因標志，有助于心肌損傷診斷與監測。至今尚未見基因標志診斷心肌損傷的文獻報道。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種方法簡單、易操作的反映心肌微小損傷情況的外周血cTnI基因檢測方法。

本發明的技術解決方案是：

一種反映心肌微小損傷情況的外周血cTnI基因檢測方法，其特征是：包括下列步驟：

(1)取抗凝靜脈血1.0ml或心肌組織50mg以Trizol試劑提取RNA，以紫外分光光度法檢測總RNA濃度，取總RNA2μg以DEPC水補充至總量為13μl，置75℃3分鐘，置冰中3分鐘，搖勻，試管中加入5×逆轉錄緩沖液4μl、隨機引物(100pmol)1μl、dNTPs(2.5mMol)1μl、RNAsin0.5μl、逆轉錄酶0.5μl混勻，置DNA480型擴增儀中，42℃60分鐘合成cTnI-cDNA，再95℃5分鐘后于4℃保存；

(2)參照cTnI基因序列設計巢式PCR引物擴增cTnI基因片段，cTnI基因擴增，第一階段以外部引物；第二階段以內部引物；GAPDH基因擴增采用一階段法；反應總體積50μl中含DEPC水31.5μl、10×緩沖液5μl、MgCl₂(25mMol)3μl、dNTPs(10mMol)1μl、上游和下游引物(100pMol)各1μl、cTnI-cDNA模板5μl、DNA聚合酶(1u/μl)2.5μl。在預變性95℃5分后，以95℃20秒、60℃1分、72℃1分進行40個循環，再于72℃延伸10分，PCR產物在含溴乙錠的2％瓊脂糖凝膠中電泳，以圖像分析儀攝像、分析。

人心肌組織及外周血中cTnI及內參基因GAPDH的引物序列及產物為：