[發明專利]對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法無效
| 申請號： | 200810024110.6 | 申請日： | 2008-04-30 |
| 公開（公告）號： | CN101270365A | 公開（公告）日： | 2008-09-24 |
| 發明（設計）人： | 貢成良;薛仁宇;曹廣力;沈衛德 | 申請（專利權）人： | 蘇州大學 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/11;A01K67/04 |
| 代理公司： | 蘇州創元專利商標事務所有限公司 | 代理人： | 陶海鋒 |
| 地址： | 215123江蘇省*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 血液 型膿病 具有 抗性 轉基因 家蠶 制作方法 | ||
1.一種對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法，其特征在于包括如下步驟：
[1]構建用家蠶組織有活性的啟動子控制家蠶核型多角體病毒的ie-1基因的dsRNA表達盒和lef-1基因的dsRNA表達盒；
[2]將步驟[1]獲得的兩種表達盒克隆進以轉座子piggyBAC因子為基礎的帶有熒光蛋白報告基因的轉基因載體，獲得轉基因載體pigRNAi-ie-lef；
[3]用家蠶組織有活性的啟動子控制新霉素抗性基因，克隆進步驟[2]轉基因載體pigRNAi-ie-lef獲pigRNAineo-ie-lef；
[4]將轉基因載體pigRNAineo-ie-lef與輔助質粒作混合，導入初產卵，孵化后的蟻蠶用G418篩選至4齡眠，結合熒光蛋白報告基因篩選，獲得抗G418、帶有熒光蛋白報告基因的轉基因家蠶，進一步將轉基因家蠶的雜交后代，接種家蠶核型多角體病毒，通過驗證篩選獲得對血液型膿病有抗性的轉基因家蠶。
2.根據權利要求1所述的對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法，其特征在于：所述步驟[1]中，構建家蠶核型多角體病毒的ie-1基因的dsRNA表達盒和lef-1基因的dsRNA表達盒時，根據已公開的家蠶核型多角體病毒的全基因組序列，GenBank上的登錄號為L33180，選擇ie-1基因編碼區內長度為19-23nt?DNA序列作為RNAi的dsRNA設計的靶序列，構建BmNPV的ie-1基因的dsRNA表達盒，選擇lef-1基因編碼區內長度為19-23ntDNA序列作為RNAi的dsRNA設計的靶序列，構建BmNPV的lef-1基因的dsRNA表達盒；其中，以ie-1基因的起始密碼ATG的A定位為1，則ie-1基因編碼區內的dsRNA設計的靶序列的起始位點分別為第202、415、657、887、1097、1099、1127、1128、1162、1163、1329、1408、1481、1622、1623、1624、1681、1682、1696、1697位點，選擇長度為19-23nt?DNA序列作為RNAi的dsRNA設計的靶序列，構建BmNPV的ie-1基因的dsRNA表達盒；以lef-1基因的起始密碼ATG的A定位為1，則lef-1基因編碼區內的dsRNA設計的靶序列的起始位點分別為第57、134、135、222、225、226、349、419、506、507、513、518、533、611、612、616、716、778、779，選擇長度為19-23ntDNA序列作為RNAi的dsRNA設計的靶序列，構建BmNPV的lef-1基因的dsRNA表達盒。
3、根據權利要求1所述的對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法，其特征在于：步驟[3]中，所述的pigRNAineo-ie-lef通過先將家蠶組織有活性的啟動子控制的新霉素抗性基因neo表達盒克隆進以轉座子piggyBAC因子為基礎的帶有熒光蛋白報告基因的轉基因載體，然后再克隆進ie-1基因的dsRNA表達盒和lef-1基因的dsRNA表達盒獲得；
4、根據權利要求1所述的對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法，其特征在于：步驟[3]中，所述的pigRNAineo-ie-lef通過將步驟[1]獲得的表達盒克隆進以轉座子piggyBAC因子為基礎的帶有熒光蛋白報告基因的轉基因載體，獲得轉基因載體pigRNAi-ie-lef，再將用家蠶組織有活性的啟動子控制新霉素抗性基因neo表達盒克隆進轉基因載體pigRNAi-ie-lef而獲得。
5、根據權利要求1所述的對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法，其特征在于：步驟[4]中，孵化后的蟻蠶用10000μg/mL的G418篩選至4齡眠，結合熒光蛋白報告基因篩選，獲得抗G418、帶有熒光蛋白報告基因的轉基因家蠶，進一步將轉基因家蠶的雜交后代，接種家蠶核型多角體病毒，通過驗證篩選獲得對血液型膿病有抗性的轉基因家蠶。
6.一種對血液型膿病具有高抗性的轉基因家蠶制作方法，其特征在于包括如下步驟：
[1]構建用家蠶組織有活性的啟動子控制家蠶核型多角體病毒的ie-1基因的dsRNA表達盒和lef-1基因的dsRNA表達盒；
[2]用家蠶組織有活性的啟動子控制新霉素抗性基因，克隆進以轉座子piggyBAC因子為基礎的帶有熒光蛋白報告基因的轉基因載體，獲得轉基因載體pigRNAineo；
[3]將步驟[1]獲得的兩種表達盒克隆進步驟[2]得到的轉基因載體pigRNAineo獲得pigRNAineo-ie-lef；
[4]將轉基因載體pigRNAineo-ie-lef與輔助質粒作混合，導入初產卵，孵化后的蟻蠶用G418篩選至4齡眠，結合熒光蛋白報告基因篩選，獲得抗G418、帶有熒光蛋白報告基因的轉基因家蠶，進一步將轉基因家蠶的雜交后代，接種家蠶核型多角體病毒，通過驗證篩選獲得對血液型膿病有抗性的轉基因家蠶。
該專利技術資料僅供研究查看技術是否侵權等信息，商用須獲得專利權人授權。該專利全部權利屬于蘇州大學，未經蘇州大學許可，擅自商用是侵權行為。如果您想購買此專利、獲得商業授權和技術合作，請聯系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/200810024110.6/1.html，轉載請聲明來源鉆瓜專利網。
