[發(fā)明專利]核酸蛋白雙探針SPR生物傳感DNA甲基化檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810023797.1
• 申請日: 2008-04-29
• 公開（公告）號: CN101353697A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘世揚(yáng);徐建;束永前;張石江;張寄南;王芳;陳丹;黃珮珺;楊笛
• 申請（專利權(quán)）人: 潘世揚(yáng)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京中新達(dá)專利代理有限公司
• 代理人: 孫鷗

1.核酸蛋白雙探針SPR生物傳感DNA甲基化檢測方法，其特征在于以SPR芯片表面包被的核酸探針特異性識(shí)別待測樣本中靶基因啟動(dòng)子區(qū)核酸序列，繼而以MBD識(shí)別其中含有甲基化的部分，芯片表面形成核酸探針-甲基化靶核酸-MBD蛋白復(fù)合物，通過SPR角的變化，實(shí)現(xiàn)DNA甲基化的定量檢測；具體步驟如下，

(1)制備甲基化陽性標(biāo)準(zhǔn)品；

(2)采用磁珠法微量核酸提取技術(shù)，提取待測體液或組織細(xì)胞樣本DNA和甲基化陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA；

(3)制備帶生物素標(biāo)記的核酸探針，并包被于覆蓋有親和素的芯片表面；

(4)按從低濃度到高濃度的順序，依次將甲基化陽性的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，繼而通入經(jīng)修飾的MBD，根據(jù)SPR曲線的變化，分別計(jì)算不同濃度的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的SPR角的差值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(5)對芯片進(jìn)行再生，進(jìn)待測樣本DNA，繼而通入MBD；根據(jù)SPR角的變化，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本中甲基化靶基因的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸蛋白雙探針SPR生物傳感DNA甲基化檢測方法，其特征在于以帶生物素標(biāo)記的特異性核酸探針包被于覆蓋有親和素的SPR芯片表面，識(shí)別待測樣本中互補(bǔ)的核酸片段；以MBD識(shí)別被探針捕獲的互補(bǔ)核酸片段中甲基化的部分。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸蛋白雙探針SPR生物傳感DNA甲基化檢測方法，其特征在于步驟(1)中所述的制備甲基化陽性標(biāo)準(zhǔn)品是指：PCR擴(kuò)增并純化待測靶基因啟動(dòng)子核酸片段，紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行核酸定量，再行轉(zhuǎn)甲基修飾，DNA?1.3μg，10×NEBBuffer?2μl，1.6mmol/L?SAM?2μl，SssI?Methylase?4U，總體系20μl，37℃1.5h，65℃滅活15min，即得甲基化陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸蛋白雙探針SPR生物傳感DNA甲基化檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的制備帶生物素標(biāo)記的核酸探針是指：以待測基因啟動(dòng)子區(qū)富含甲基化CpG位點(diǎn)區(qū)域的核酸序列為模版，以5-mC替代C，化學(xué)合成5′端帶生物素標(biāo)記的長30-70mer的核酸探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸蛋白雙探針SPR生物傳感DNA甲基化檢測方法，其特征在于步驟(4)中所述的經(jīng)修飾的MBD是指：以膠體金或磁微球修飾MBD，以增加與甲基化CpG結(jié)合的MBD的分子量；或在MBD與甲基化CpG結(jié)合后，通入抗融合蛋白上標(biāo)簽的單抗。