[發(fā)明專利]負(fù)載重組人HSP70多肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗、制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810021896.6
• 申請(qǐng)日: 2008-08-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101461942A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 時(shí)宏珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 時(shí)宏珍
• 主分類號(hào): A61K39/39
• 分類號(hào): A61K39/39;A61K39/385;A61K39/00;A61K39/04;A61K39/21;A61K39/29;A61P31/00;A61P35/00
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1.一種激活特異性CD8T克隆的組合物，所述組合物由序列為AAGIGILTV的MART1多肽、rhHSP70和DC細(xì)胞制備而來(lái)：

(1)黑色素瘤抗原多肽與rhHSP70蛋白的準(zhǔn)備

人工合成HLA-A201限制性黑色素瘤抗原多肽片段MART1：AAGIGILTV，以DMSO充分溶解，多肽濃度為5mg/mL；rhHSP70以PBS溶解，濃度為0.1mg/mL；

(2)rhHSP70-多肽復(fù)合物制備

取5μg?MART1多肽與10μg?rhHSP70多肽于1.5mL?EP管內(nèi)，加入400μl含10nM?ATP、1mM?KCl、2mM?MgCl₂的PBS緩沖液中，混勻后于20℃共育40分鐘，加入100nM?ADP后繼續(xù)于20℃孵育40分鐘，將溶液移至0.5mL內(nèi)含14kD分子量超濾膜的微型透析管內(nèi)，過(guò)夜，除去未結(jié)合多肽，制備出rhHSP70-MART1復(fù)合物；

(3)體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞

采集新鮮肝素抗凝的HLA-A201⁺黑色素瘤患者外周血或HLA-A201⁺正常健康人外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法后獲得外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，將PBMCs懸浮于含2％(v/v)滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為2～3×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml；按每孔3ml接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，于5％(v/v)CO₂、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置90min使單核細(xì)胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細(xì)胞；于每孔加入3ml?DC誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，所述的DC誘導(dǎo)培養(yǎng)基I是含5％(v/v)滅活人AB血清、100ng/ml?rhGM-CSF和300ng/ml?IFNα的RPMI1640培養(yǎng)基；于誘導(dǎo)第3天，每孔輕輕吸去1mL培養(yǎng)上清，加入1ml新鮮的DC誘導(dǎo)培養(yǎng)基I繼續(xù)誘導(dǎo)；于第5天收獲DCs，用PBS進(jìn)行洗滌并懸浮于PBS溶液中，濃度為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml；

(4)HSP70-多肽復(fù)合物負(fù)載DCs

取250μl上述已制備的rhHSP70-MART1多肽復(fù)合物，加入至1mL誘導(dǎo)的DCs中，混勻后于27℃-30℃培育4-6小時(shí)；

(5)收集上述細(xì)胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2％(g/100ml)人白蛋白的生理鹽水中，濃度為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，即制得所述的組合物。

2.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物刺激CD8T克隆增殖。

3.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物增強(qiáng)CD8T克隆殺傷靶細(xì)胞的能力。