[發明專利]一種枯草芽孢桿菌生產γ－谷氨酰轉肽酶的方法

有效

• 申請號: 200810021188.2
• 申請日: 2008-08-19
• 公開（公告）號: CN101363014A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: 江波;張濤;帥玉英
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種枯草芽孢桿菌生產γ-谷氨酰轉肽酶的方法，屬于食品生物技術領域。

背景技術

γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，γ-GTP，EC2.3.2.2)，即γ-谷氨酰轉移酶，是生物體內谷胱甘肽代謝的相關酶之一，也是催化轉移L-γ-谷氨酰基的特異性酶。γ-谷氨酰轉肽酶可以催化以下3類反應：

(1)轉肽反應：

(2)自轉肽反應：

(3)水解反應：

它在生物體中分布相當廣泛，從細菌到高等哺乳動物體中都有該酶的存在。血清中γ-谷氨酰轉肽酶活性是肝膽疾病的相當靈敏的指示劑，在臨床上已經用于肝臟細胞癌變和肝癌形成的檢測指標物，現也研究其在其他組織病變過程中的作用。該酶還是γ-谷氨酰循環中的關鍵酶，在細胞中通過轉肽反應可以進行細胞間的氨基酸分子運輸。目前，廣大研究者更為關注的是該酶在生物催化合成中的重要應用：(1)催化合成藥物或藥物前體，如帕金森綜合癥的前體藥物L-γ-谷氨酰-L-多巴的合成、谷胱甘肽的合成、L-γ-谷氨酰-牛磺酸的合成(該物質會影響腦中的單胺的濃度、貓的攻擊性行為、以及電擊引起的失憶癥，還有抗癲癇等)，γ-D-谷氨酰-L-色氨酸(SCV-07)合成(SCV-07是一種新型的廣譜免疫調節類化合物，其作用類似胸腺素α1)、以及茶氨酸的合成(該物質更是具有降血壓、抗腫瘤、提高免疫力、抗抑郁、神經保護作用、改善經期綜合征、減輕體脂等保健作用)。(2)氨基酸的修飾和改性，將具有苦味的氨基酸(L-型的芳香氨基酸、堿性氨基酸及有支鏈的氨基酸)通過γ-谷氨酰化可對其進行風味的改變，通過γ-谷氨酰化還能增強某些物質的穩定性和可溶性，如胱氨酸通過γ-谷氨酰化轉變為γ-谷氨酰-胱氨酸后，其可溶性極大增強；γ-谷氨酰-皮啡肽因其穩定性增強可用作具有鎮痛作用的前體藥物。(3)氨基頭孢菌烷酸(7-ACA)的制備，7-ACA是生產頭孢菌素的關鍵性中間體。

γ-谷氨酰基化合物是一類重要的氨基酸衍生物，在食品、醫藥、化妝品等領域具有廣泛的應用前景。利用γ-GTP生物催化合成γ-谷氨酰基化合物是制備系列γ-谷氨酰基化合物的有效手段。

γ-谷氨酰轉肽酶制備主要有這樣兩個途徑：一是從動植物中富含酶的組織中提取純化；二是微生物法生產酶蛋白。由于以前采用這兩種方法獲得γ-GTP都比較困難，導致γ-GTP的產量較低，使得采用酶法合成γ-谷氨酰基類化合物一直處于實驗室的研究階段。自從1952年有人嘗試從普通變形桿菌中分離γ-GTP，才開始了微生物法生產酶蛋白的研究。此后Suzuki等利用基因工程構建E.Coli的γ-GTP生產菌，但由于γ-GTP含量極低，無法分離而不具有商業價值。近來淺田芳宏等發現有些芽孢桿菌可在體外分泌γ-GTP，并得到一株最高可產γ-GTP每毫升3.0U的菌株。國內南京工業大學徐虹教授等人從土壤里篩選分離得到一株產胞外γ-GTP的Bacillus?subtilis?NX-2，其酶活力達到每毫升3.2U。可見采用產酶性能優良的菌種，尤其是產胞外γ-谷氨酰轉肽酶的菌株，摸索出成熟的工藝條件，對以后大規模生產γ-GTP至關重要。

發明內容

本發明目的是提供一種枯草芽孢桿菌生產γ-谷氨酰轉肽酶的方法。

本發明所使用的枯草芽孢桿菌，是本發明人等先前從發酵食品蝦醬中篩選得到的一株可以高產γ-谷氨酰轉肽酶的菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)SK11.004，已保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2008年7月10日，保藏編號：CCTCC?NO：M?208083。

本發明的技術方案：一種枯草芽孢桿菌生產γ-谷氨酰轉肽酶的方法：

(1)對γ-谷氨酰轉肽酶產生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)SK11.004進行斜面、種子、發酵三級培養；

斜面培養：培養基組分以g/L計：蛋白胨8～10，牛肉膏3～5，氯化鈉3～5，瓊脂20，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min，培養條件為：培養溫度35～40℃，培養時間8～16小時；