[發(fā)明專利]一種檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810020809.5
• 申請(qǐng)日: 2008-08-01
• 公開（公告）號(hào): CN101328493A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊斌;孫則禹;戴玉田
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 樓高潮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物材料的檢測(cè)方法，具體地說是涉及一種檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法。?

背景技術(shù)

目前，無細(xì)胞基質(zhì)是研究和應(yīng)用較多的生物材料，已經(jīng)顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景，如小腸粘膜下層(SIS)，膀胱無細(xì)胞基質(zhì)(BAM)。研究者用尿素，鹽酸胍等將SIS和BAM中的總蛋白抽提出來，利用分子生物學(xué)技術(shù)，如免疫印記(WB)、免疫組化(IHC)對(duì)生長因子進(jìn)行定性檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)對(duì)生長因子進(jìn)行定量檢測(cè)，還將抽提物用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以觀察其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，SIS中存在有VEGF，bFGF以及TGF-β等生長因子；豬膀胱細(xì)胞外基質(zhì)含有BMP4，PDGF-BB，KGF，TGFβ1，IGF，bFGF，EGF和TGFα等生長因子；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，SIS和BAM的抽提物能促進(jìn)細(xì)胞的增殖(Hodde等，Endothelium.2001；8(1)11-24.Voytik-Harbin等，J?Cell?Biochem.1997；67(4)：478-91.McDevitt等，J?Biomed?Mater?Res?A.2003；67(2)：637-40.Chun等，Biomaterials.2007；28(29)：4251-6)。上述SIS和BAM抽提液的制備較復(fù)雜，而且會(huì)引入尿素、鹽酸胍等試劑。林茂虎等人作了改進(jìn)，將SIS在磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行孵育；結(jié)果表明，利用ELISA法，在孵育液中檢測(cè)到了VEGF和bFGF的存在，這些生長因子是由SIS中釋放PBS中的；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，該孵育液能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖(林茂虎等，中國康復(fù)理論與實(shí)踐2006；12(7)：578-81)。另外，也有研究者用WB、IHC證實(shí)在SIS的抽提物中有黏附因子纖維連接蛋白的存在(Timothy等，Tissue?Engineering.1998，4(1)：75-83)，而對(duì)于BAM中是否保留有這類黏附因子還不得而知。?

利用無細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行組織、器官的替代后，組織、器官的修復(fù)和再生是一個(gè)復(fù)雜的過程，這不僅需要臨近的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(如膀胱平滑肌細(xì)胞)的向替代區(qū)遷移，黏附到無細(xì)胞基質(zhì)上，在缺損區(qū)不斷增殖，從而修復(fù)缺損區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能；還需要臨近的血管內(nèi)皮細(xì)胞向修復(fù)區(qū)遷移、增殖，以建立修復(fù)區(qū)的血液循環(huán)。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)本身所包含的生物活性因子成分復(fù)雜、種類繁多，除了含有促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子外，還包括有促進(jìn)細(xì)胞黏附的黏附因子以及促進(jìn)細(xì)胞遷移的趨化因子。目前，無細(xì)胞基質(zhì)(如SIS和BAM)的制備方法各異，各種各樣的脫細(xì)胞技術(shù)均可能影響細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子，使得制備的無細(xì)胞基質(zhì)不保留或僅保留少量的生物活性因子。因此，制備無細(xì)胞基質(zhì)時(shí)，盡可能地保留這些細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子，將有利于組織、器官的修復(fù)和再生。?

WB、IHC以及ELISA等技術(shù)均需要針對(duì)特定物種的特異性抗體，利用針對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子的特異性抗體(如前所述的針對(duì)BMP4，PDGF-BB，KGF，TGFβ1，IGF，bFGF的抗體)即可以檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中是否保留有這些生物?活性因子，但是這些檢測(cè)技術(shù)并不能區(qū)分具有生物學(xué)活性的因子和已經(jīng)變形、喪失活性的因子；也不能明確無細(xì)胞基質(zhì)中這些因子的生物學(xué)效應(yīng)。由于細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子成分十分復(fù)雜、種類繁多，因此，對(duì)于不能提供特異性抗體的生物活性因子，則不能采用此類技術(shù)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。而且，WB、IHC以及ELISA等定性定量檢測(cè)技術(shù)操作復(fù)雜，成本較高。?

利用細(xì)胞生物學(xué)的方法，無需使用大量的特異性抗體，可以直接檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。但是，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，僅能單一的檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生長因子，而對(duì)于在組織、器官的修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用的黏附因子和趨化因子還不明確。因此，除了檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生長因子外，還需要同時(shí)檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的黏附因子和趨化因子。?

綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要提供一種檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，有效地檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的黏附因子、生長因子和趨化因子。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，通過細(xì)胞生物學(xué)的方法，有效地檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的黏附因子、生長因子和趨化因子。?

本發(fā)明的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)施?

一種檢測(cè)無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，其特征在于所述的生物活性因子包括黏附因子、生長因子和趨化因子，該檢測(cè)方法的步驟如下：?

a)種子細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；?