[發(fā)明專利]一種利用全血直接擴(kuò)增核酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810018710.1
• 申請日: 2008-01-21
• 公開（公告）號: CN101492670A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周國華
• 申請（專利權(quán)）人: 華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 夏 平;劉成群

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用全血直接擴(kuò)增核酸的方法。

背景技術(shù)

PCR是一種利用DNA聚合酶將極微量的標(biāo)本百億倍甚至千億倍擴(kuò)大的現(xiàn)代技術(shù)， 其起始模板通常是基因組DNA。基因組DNA主要來源于血液，需要對其進(jìn)行提取，除 了商品化試劑盒外，還有很多其他的提取方法，如：酚/氯仿抽提法、碘化鉀法、直接煮 沸法、高鹽沉淀法【吳清敏，劉巧紅，滕云，等.外周血提取DNA方法的比較.中華檢 驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(7)：445-446】等等。這些方法雖然有效，但是操作步驟繁瑣， 容易造成污染，而且基本上都需要用到恒溫水浴鍋、低溫高速離心機(jī)等裝置，對儀器設(shè) 備和試劑的要求都比較多。如果不經(jīng)過DNA提取而直接進(jìn)行PCR，則可以大大節(jié)約實(shí) 驗(yàn)時間和成本，同時也避免了因多步操作可能造成的樣本間交叉污染。已有文獻(xiàn)報道采 用全血直接進(jìn)行DNA擴(kuò)增。如：McCusker?J.等人對一定量的全血標(biāo)本95℃預(yù)處理15 分鐘，以降低血液中的PCR抑制成份對擴(kuò)增的影響【McCusker?J，Dawson?M?T，Noone?D， et?al.Improved?method?for?direct?PCR?amplification?form?whole?blood.Nucleic?Acids Research，1992，20(24)：6747-6755】；Mercier?B在全血擴(kuò)增前利用3個循環(huán)的預(yù)變性程序 來去除血液中的PCR抑制成分【Mercier，B.，Gaucher，C.，F(xiàn)eugeas，O.，et?al.Direct?PCR from?whole?blood?without?DNA?extraction.Nucleic?Acids?Research，1990，18(19)： 5908-5912】等等。這些方法雖然以全血為起始模板直接擴(kuò)增DNA，但操作不夠簡便， 條件難以控制，重復(fù)性不好，不能形成商品化試劑盒，不利于推廣使用，且相關(guān)研究未 見后續(xù)進(jìn)一步報道。

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的是提供一種利用全血直接擴(kuò)增核酸的方法。

本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的：

一種利用全血樣本為起始材料直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，包括取全血樣本為起始材 料，加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，加入擴(kuò)增目的基因所需引物，直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，測 定擴(kuò)增產(chǎn)物，其中：擴(kuò)增核酸反應(yīng)試劑中的緩沖液的pH值在8.5-10.0之間，鎂離子濃 度在1.5-3.0mmol/L之間。

所述的方法，其中：緩沖液的pH值為8.8-9.9，鎂離子濃度為1.5-2.5mmol/L。

所述的方法，其中直接是指不經(jīng)過提取血液樣本中的基因組DNA而進(jìn)行核酸擴(kuò)增 反應(yīng)。

所述的方法，其中全血是指液體血液或干血。

液體血液可以是加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液。干血可以是保存在固體載 體上的干血，如濾紙血、布料血等。

所述的方法，其中核酸擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)、 鏈替代擴(kuò)增(SDA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)或依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。

所述的方法，其中緩沖液是指濃度為10-100mmol/L的三(羥甲基)氨基甲烷一鹽 酸。緩沖液可用鹽酸、苛性鈉調(diào)節(jié)酸堿度。

液體全血樣本直接加到擴(kuò)增用反應(yīng)管的底部，不對反應(yīng)管進(jìn)行任何攪動。

本發(fā)明的有益效果：

由于通常采用PCR技術(shù)擴(kuò)增核酸，這里以PCR擴(kuò)增為例介紹擴(kuò)增效果。跟普通基 因擴(kuò)增反應(yīng)一樣，即在一只或多只PCR專用試管中，加入PCR擴(kuò)增用試劑，除緩沖液 和擴(kuò)增模板不同外，其余成分與普通PCR試劑完全相同。即要加入擴(kuò)增引物，脫氧核 糖核酸，Taq聚合酶，0.5-5微升血液或小的含有干血的濾紙片。PCR緩沖液的pH值在 8.5-10.0之間，鎂離子濃度在1.5-3.0mmol/L之間，提供鎂離子的物質(zhì)可以是氯化鎂或 醋酸鎂。在普通PCR擴(kuò)增儀器上完成循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。可以進(jìn)行多對引物的同時擴(kuò)增， 即多重PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，可以采用凝膠電泳法、芯片電泳法等分離方法測定擴(kuò) 增產(chǎn)物。在本發(fā)明中，采用不同pH的PCR緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果表明，使用pH8.5 以上(pH?8.5-10.0)的PCR緩沖液能得特異性的PCR產(chǎn)物。