[發明專利]一種地衣芽孢桿菌工業生產菌株遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200810018458.4
• 申請日: 2008-02-02
• 公開（公告）號: CN101230329A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 王正祥;牛丹丹
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/11;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/75;C12R1/10
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種地衣芽孢桿菌工業生產菌株遺傳轉化方法，屬于微生物基因工程和發酵工程領域。

背景技術

地衣芽孢桿菌是生產高溫α-淀粉酶、堿性蛋白酶、新型抗菌肽、新型生物可降解聚合物(如聚谷氨酸、聚賴氨酸等)的主要菌株。實現對其高效遺傳改良將是實現上述重要工業產品工業化生產和產業化的重要保障。然而，無論是地衣芽孢桿菌試驗菌株還是工業菌株，由于有效的遺傳轉化技術的缺乏，對其進行目標導向性遺傳改良是極為困難的和很少能成功的。因此，研究和解決地衣芽孢桿菌的遺傳轉化體系，實現其遺傳轉化，對定向遺傳改造地衣芽孢桿菌成為高效工業生產菌種具有極為重要的意義。

從自然界獲得的微生物菌種的生產性能往往達不到商業開發價值，需要對其進行性能改造--育種。微生物育種的本質是對微生物菌種進行遺傳改良和異源基因的高效表達。微生物菌種遺傳改良即對微生物細胞的遺傳信息的儲存載體即DNA或基因進行改變，由此改變其遺傳信息，進而改變其生理生化特性，獲得生產性能更好的菌種?；蛑傅氖且欢尉幋a具有特定功能多肽的DNA序列，是遺傳功能作用發揮的基本單位或功能單位，一個生物體所有基因的總和為一個基因組。每個基因都具有完整的、能夠發揮其功能的特定結構，即具有特殊的核苷酸(組成基因的化學物質，主要為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C))序列。異源基因主要用分子克隆技術從其它生物體中獲得。異源基因的表達也是微生物菌種改良的重要組成部分。

微生物菌種育種的方法有多種，如傳統的誘變法、雜交法、原生質體融合法，以及現代的分子育種法。分子育種法是現代微生物菌種育種的最主要組成部分。工業上使用的優良菌種有超過90％的菌種是通過分子育種獲得的。

分子育種指的是運用分子克隆和體外重組等現代技術直接改變微生物菌種的基因(基因型改變)，由此賦予微生物菌種新的優良性狀(表現型改變)。分子克隆和體外重組技術于1973年建立。其核心或通用過程是：運用物理、化學或生物手段將決定微生物菌種特定性狀或指導特定產物合成的基因分離、純化、單克隆化，然后再在限制性酶和連接酶等的作用下重新組合成新的基因，即體外重組；再將此新的基因轉移入微生物菌種內并讓其發揮功能。這里的限制性酶系能夠特異性切割DNA特定序列的酶，如來源于大腸桿菌的EcoRI能夠特異性切割DNA分子中的GAATTC序列。這里的連接酶指的是能夠將兩個或多個兩段靠近的DNA分子連接起來，形成一個新的DNA分子。

微生物菌種的分子育種，需要將上述獲得的基因轉移入微生物菌種內?；蜣D移技術是實現微生物菌種分子改良的關鍵技術之一。

實現為微生物菌種基因轉移的方法有感受態轉化法、原生質體轉化法、電穿孔法、脂質體介導法、轉染法、基因槍法、微注射法等。適合微生物，特別是細菌遺傳轉化常用方法主要有感受態轉化法、原生質體轉化法、電穿孔法等。

感受態轉化法是對大腸桿菌進行基因轉移的基本方法。此方法是利用大腸桿菌在特定培養和誘導條件下可以形成攝取外源DNA分子并將其運送到其細胞內的特殊生理狀態(即感受態)，將外源DNA分子與形成了感受態的大腸桿菌混合一段時間，在此感受態下將外源DNA分子吸收并運送入其細胞中。

原生質體轉化法(諸葛健、王正祥.工業微生物實驗技術手冊，1994)是實現若干細菌遺傳轉化的有效方法。其基本技術路線是：新鮮培養的細菌在高滲溶液中用適宜的酶(如溶菌酶)將其細胞壁(細菌細胞膜外側的結構，主要由多糖和蛋白質組成)水解，獲得僅有細胞膜包圍的原生質，即原生質體；將制備好的待遺傳轉化的DNA分子混入其中，加入適量的轉化促進劑(如聚乙二醇)，共同孵育一段時間；將此轉化混合物涂布或摻入補加有一定選擇壓力(如抗生素)的原生質體再生培養基中進行3～7天的再生培養，讓其重新生長出細胞壁(即再生)，并通過抗生素選擇(選擇培養)出已經獲得外源DNA分子的菌種(即轉化子)。

電穿孔法(諸葛健、王正祥.工業微生物實驗技術手冊，1994)是實現絕大多數細菌遺傳轉化的有效方法。其基本技術路線是：新鮮培養的細菌與制備好的待遺傳轉化的純化DNA分子混合，在電穿孔儀的協助下，通過瞬間高壓電場的作用力將DNA分子送入細胞內；將此轉化混合物涂布或摻入補加有一定選擇壓力(如抗生素)的培養基中進行2～3天的選擇培養，獲得轉化子。