[發(fā)明專利]一種精子染色質(zhì)擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810016505.1
• 申請日: 2008-05-28
• 公開（公告）號: CN101319251A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邱毅;王磊光;張麗紅
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N1/30
• 代理公司: 山東濟南齊魯科技專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 宋永麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)臨床上使用的試劑，是一種精子染色質(zhì)擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法。

背景技術(shù)

目前，世界許多國家都在研究精子成熟過程中因受內(nèi)外環(huán)境影響形成DNA碎片出現(xiàn)的DNA完整性異常，從而引起的精子形態(tài)和功能異常。由于在男性不育檢測中DNA的完整性是精液的常規(guī)檢測，也是評估男性不育的主要指標，因此，如何檢測精子DNA完整性是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題之一。國外比較領(lǐng)先的檢測方法為精子染色質(zhì)擴散試驗，其英文名為spermchromatin?dispersion，簡稱SCD，其商品化的試驗盒已推廣使用。SCD檢測方法具有較多優(yōu)點，例如：簡單、快速、準確、分辨率高等，但是，由于試劑盒包含知識產(chǎn)權(quán)，因此該試劑盒價格昂貴，受此限制，目前在我國尚未推廣應(yīng)用，并且，這種試劑盒中的精子核蛋白裂解液采用聚乙二醇辛基苯基醚，十二烷基碘酸鈉等成份，這些成份均為化學(xué)試劑，其異味、刺激性及腐蝕性較大，并具有毒性成份，污染環(huán)境等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種精子染色質(zhì)擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法，使它具有造價低、無腐蝕，無毒，操作簡便，易于推廣的優(yōu)點。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種精子染色質(zhì)擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法，其步驟如下：

①精確配制精子裂解液

精子裂解液為每100毫升蒸餾水中含三羥甲基氨基甲烷4.844克、氯化鈉11.7克、二硫蘇糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二鈉鹽12.32克，PH值為7.5；

②將裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小時取出，置入22℃室溫內(nèi)；

③將精液稀釋至5-10×10⁶/ml，在室溫37℃下將0.3ml的精液稀釋，加入0.7毫升的1％低熔點瓊脂糖內(nèi)，混勻；

④取稀釋精液50微升置入用0.65％瓊脂糖處理好的載玻片上，蓋上22×22mm蓋玻片，放置在冰箱內(nèi)5分鐘，冰箱內(nèi)溫度為4℃；

⑤冰箱內(nèi)取出后將蓋玻片移走，將載玻片水平浸入0.08摩爾鹽酸HCl中變性7分鐘取出；

⑥步驟⑤中取走的載玻片再水平浸入步驟①中所述的精子裂解液中20分鐘；

⑦將步驟⑥中的載玻片用緩沖液沖洗5分鐘，緩沖液中各物質(zhì)及含量為：三羥甲基氨基甲烷10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二鈉鹽0.58克/升；

⑧用70％、90％、100％乙醇各2分鐘脫水；

⑨用瑞氏法或姬姆薩-瑞氏法或天藍法染精子，在光學(xué)顯微鏡下觀察分析精子DAN碎片。

本發(fā)明的方法，為我國推廣應(yīng)用SCD方法檢測精子DNA完整性提供了重要的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述方法中采用的裂解液用皂角或桔梗提取物替代了化學(xué)試劑，從而減少了化學(xué)試劑的應(yīng)用，減少污染、無刺激性、無腐蝕、無毒，并使裂解液制造成本大幅降低，易于推廣應(yīng)用。本發(fā)明裂解液為精子染色質(zhì)擴散實驗試劑盒的裂解液，試驗結(jié)果表明：采用本發(fā)明所述的裂解液用SCD方法檢測精子DNA完整性的效果與國外同類試劑盒的檢測效果完整性一致。SCD試驗后經(jīng)染色能夠在光學(xué)顯微鏡下清晰的觀察保留尾巴的單個精子DNA的完整性，根據(jù)暈環(huán)的大小，能夠準確判定精子DNA是否有碎片，從而對男性生育力進行準確評估。

本發(fā)明所述方法可由附圖1、2、3、4、5、6、7中清楚得出：正常精子沒有DNA碎片，具有大大的暈環(huán)或中等暈環(huán)，如附圖1、2所示，存在DNA碎片的精子沒有暈環(huán)形成或有很小的暈環(huán)，或沒有暈環(huán)且著色很淡，呈退化跡象，如附圖3、4、5所示。上述試驗進一步表明，本發(fā)明方法能夠準確判定精子DNA是否具有完整性。上述試驗結(jié)果還可具體描述為：計數(shù)500個精子，觀察精子暈環(huán)大小，根據(jù)暈環(huán)與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無暈環(huán)4個等級，大和中暈環(huán)表示精子DNA完整無碎片，小和無暈環(huán)表示精子DNA斷裂為碎片。小暈環(huán)以≤精子頭直徑四分之一為判斷標準，中暈環(huán)＞精子頭直徑四分之一而≤精子頭直徑三分之二，大暈環(huán)＞精子頭直徑三分之二。

本發(fā)明方法中的裂解液所含的皂角或桔梗提取物不使蛋白變性，絲毫不破壞精子尾部。本發(fā)明方法中所述的裂解液實現(xiàn)了精子DNA檢測簡單、快速、準確、廉價、分辨率高的目的。本發(fā)明的方法還具有操作簡便、準確性好，分辨率高及成本低等優(yōu)點。

本發(fā)明的方法以試劑盒商品推廣應(yīng)用，試劑盒包括：

1、DNA變性染液；

2、精子核蛋白裂解液；

DNA變性染液為公知技術(shù)。