[發(fā)明專利]一種重組風(fēng)疹病毒E1蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810012772.1
• 申請日: 2008-08-13
• 公開（公告）號: CN101402960A
• 公開（公告）日: 2009-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳麗霞;趙玉紅;于庭;包洪;王貴全;李鳳娣;姜禾;董亞俊;徐田雪
• 申請（專利權(quán)）人: 吳麗霞;趙玉紅;于庭
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C07K14/19;C12N15/63;C12N1/21;G01N33/68;C07K16/10;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 楊 華

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種重組風(fēng)疹病毒E1蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

風(fēng)疹病毒(rubella?virus，RV)RV是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，人是其唯一的自然宿主。風(fēng)疹本身并不嚴(yán)重，后天感染主要表現(xiàn)為急性發(fā)熱、頜下淋巴結(jié)腫大等癥狀。RV最大的威脅是它的致畸性。孕婦感染RV可對胎兒產(chǎn)生先天性傷害，尤其是妊娠前3個月如感染RV，可通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，或新生兒的一系列器官畸形，即先天性風(fēng)疹綜合征。建立RV感染的快速、準(zhǔn)確檢測方法是預(yù)防RV感染的關(guān)鍵所在。

目前，風(fēng)疹病毒感染診斷方法主要有病毒分離法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、IgG抗體親和試驗、放射免疫技術(shù)、核酸雜交法、逆轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR，這些方法多基于高特異性的抗原建立。

目前常用的抗原是從病毒中提取抗原，全病毒抗原組成的診斷試劑盒：即風(fēng)疹病毒感染BHK21或非洲綠猴腎上皮細(xì)胞，病變大于80％以上時收集培養(yǎng)物，超速離心后分離病毒，經(jīng)過反復(fù)凍融，超聲破碎后制得全病毒抗原。這是目前商業(yè)化風(fēng)疹抗體診斷試劑盒的主要應(yīng)用抗原，但病毒產(chǎn)量低，所得病毒抗原純度較低，在檢測中，與其它病毒易有交叉，特異性差，準(zhǔn)確性較低等。

部分純化的病毒抗原組成的診斷試劑盒：

將全病毒抗原采用一些或一系列生化方法如分級沉淀、離子交換、分子篩等方法，分離出病毒的某些特定成分，用于血清學(xué)診斷。但是，風(fēng)疹病毒的E1/E2/C抗原成分的分離較為困難，特別是主要抗原成分E1的分離純化更加困難，基本沒有用于商業(yè)化診斷試劑盒的研究和開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種用基因工程方法生產(chǎn)，與常用的病毒提取抗原組分相比，可為風(fēng)疹病毒感染IgM抗體的檢測提供更為特異、準(zhǔn)確的抗原原料，即重組風(fēng)疹病毒E1蛋白。

本發(fā)明的第二目的是提供一種重組風(fēng)疹病毒E1蛋白在檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體感染的試劑盒中應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的是提供該重組風(fēng)疹病毒E1蛋白在制備單抗、多抗及蛋白芯片中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種編碼風(fēng)疹病毒E1蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQID?NO：1所示。同時提供了由該重組DNA序列編碼的重組風(fēng)疹病毒E1蛋白，其氨基酸序列如SEQID?NO：2所示。

一種重組風(fēng)疹病毒E1蛋白的表達(dá)載體，它是將如SEQID?NO：1所示的重組DNA序列插入到質(zhì)粒pET-32a上得到的重組質(zhì)粒pET-32a-E1，其質(zhì)粒圖譜如附圖1所示。將表達(dá)載體pET-32a-E1導(dǎo)入大腸桿菌中，得到表達(dá)重組風(fēng)疹病毒E1蛋白的工程菌株。

一種檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體感染的試劑盒，該試劑盒中含有SEQID?NO：2所示的重組風(fēng)疹病毒E1蛋白。

所述的檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體感染的試劑盒，該試劑盒組成如下：

1)反應(yīng)板：用抗人IgM抗體包被液包被空白板，40ng/100μl/孔，4℃靜置16～24小時，洗滌扣干后，加入封閉液，200μl/孔，37℃靜置2小時，棄液、干燥后封裝；

其中，優(yōu)選，包被抗人IgM抗體的濃度是40ng/孔；

2)酶結(jié)合物：將重組風(fēng)疹病毒E1蛋白與酶標(biāo)抗原稀釋液混合均勻；

其中，優(yōu)選，重組風(fēng)疹病毒E1蛋白的濃度為4mg/mL。

3)濃縮洗液：pH7.4，0.2M?PBS，2％吐溫-20；

4)底物液A：pH4.5，0.1M檸檬酸-醋酸鹽緩沖液，0.05％過氧化氫；

5)底物液B：50％甲醇，0.05％3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；

6)終止液：1M硫酸。

檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體感染的試劑盒，其組分中的抗原是所述的重組風(fēng)疹病毒E1蛋白。用于標(biāo)記重組風(fēng)疹病毒E1蛋白的標(biāo)記物選自酶、熒光物質(zhì)、膠體金中的一種或多種，標(biāo)記物的制備采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。所述試劑盒還包括固定抗體的固相，固相可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常用固相，例如聚苯乙烯、微量滴定板、免疫層析用濾紙等。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的試劑盒采用酶標(biāo)抗原，其中，包被抗人IgM抗體的濃度是40ng/孔，包被液由0.05mol/L的碳酸鹽緩沖組成，pH＝9.6；封閉液由0.01mol/L?PBS、0.2％酪蛋白和0.1％硫柳汞鈉組成，pH＝8.0；酶標(biāo)抗原稀釋液由0.01mol/L?PBS、0.5％酪蛋白和0.1％硫柳汞鈉組成，pH＝7.2。