[發明專利]一株甘蔗鐮孢轉化人參屬植物總皂苷制備抗癌有效部位的方法

有效

• 申請號: 200810010680.X
• 申請日: 2008-03-17
• 公開（公告）號: CN101537024A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 趙余慶;韓穎;姜彬慧;胡筱敏
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: A61K36/258
• 分類號: A61K36/258;A61K36/424;C12N1/20;A61P35/00;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司
• 代理人: 李宇彤

1.一株甘蔗鐮孢轉化人參屬植物總皂苷制備抗癌有效部位的方法，其特征在于：轉化方法如下：

將甘蔗鐮孢接種到含有人參屬植物總皂苷的溶液中，在酵解溫度25-45℃，pH值5.0-7.0,?酵解時間2h-15d,?轉化液為水溶液，總皂苷與微生物菌株甘蔗鐮孢的比例為4：1-8：1的條件下，將反應產物去除微生物后注入到D101大孔吸附樹脂柱內，用水沖洗至無色，再用乙醇梯度沖洗樹脂柱；將80-90%乙醇洗脫液濃縮，揮發至干，獲得轉化總產物，即可獲得有效部位，收率70-90%。

2.根據權利要求1所述的一株甘蔗鐮孢轉化人參屬植物總皂苷制備抗癌有效部位的方法，其特征在于：所述的一株甘蔗鐮孢是通過如下方法培育而成的：

（1）土壤微生物富集法分離微生物

a?、微生物的富集：利用無菌器皿取栽培人參的土樣1g，加入10mL無菌生理鹽水，震蕩片刻，制成土壤懸液，取1mL懸液分別放入盛有25mL富集培養基1的三角瓶中，生化培養箱中28-30℃，48h；

b?、菌株的初篩：用稀釋平板涂布法將富集培養基1中生長的微生物分別接入到初篩培養基2中，每種稀釋濃度接3個平行樣，接種量為0.2mL，將接種后的平面皿先正置于28-30℃的培養箱中24h，后在倒置于培養箱中培養3-4天；

（2）土壤液稀釋法分離微生物

菌株的初篩：用稀釋平板分離法將不同濃度的土壤稀釋液分別接入到初篩培養基2中，每種稀釋濃度接3個平行樣，接種量為1mL，將接種后的平面皿倒置于28-30℃的培養箱培養3-4天；

（3）菌種的分離、純化培養

將初篩平板上的單菌落進行分離、純化用平板劃線分離法將各個單菌落分別接種于分離培養基3中，倒置于28-30℃的培養箱培養3-4天，待菌株生長比較旺盛時，再將分離、純化獲得純菌株接入液體分離培養基4中，30℃、160r/min搖床中培養2-3天；

（4）菌種的復篩

將液體分離培養基4中生長的菌體分別轉移到復篩培養基5中，30℃、160r/min搖床中培養2-3天，觀察菌體的生長情況及對三七皂苷的轉化作用，選擇生長情況及對三七皂苷的轉化作用，選擇生長情況良好且具有較高的轉化作用的菌株作為實驗菌，將其命名為G，進一步經中科院微生物所對純菌株進行鑒定，該菌株為甘蔗鐮孢，甘蔗鐮孢菌落在PDA培養基上，25℃7天直徑86mm，質地絨氈狀，白色，無滲出液；菌落反面淺紫色，菌落在SNA培養基上，25℃7天直徑78mm，質地薄絨氈狀，無滲出液；菌落反面無色，小型分生孢子聚集成頭狀，0-1隔，短桿狀或彎月形，5.5-19×1.8-3.2μm；大型分生孢子細，多為3隔，一端鈍圓，一端較尖，35-40×3.0-4.1μm；

????所述的富集培養基1組成為葡萄糖4.0g，三七莖葉皂苷6.0g，?KH₂PO_4??1.0g，?CMC?10.0g，MgSO₄·7H₂O?0.2g，青霉素G納0.1g，蒸餾水1000mL；初篩培養基2組成為牛肉膏?5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1?5.0g，瓊脂?20.0g，蒸餾水1000mL，pH?7.6；分離培養基3組成為牛肉膏?5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1?5.0g，瓊脂?20.0g，蒸餾水1000mL，pH?7.6；分離培養基4組成為牛肉膏?5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1?5.0g，蒸餾水1000mL，pH?7.6；復篩培養基5組成為三七莖葉皂苷5.0g，蛋白胨3.0g，KH₂·?PO_4??1.0g，NaCL?5.0g，MgSO₄·7H₂O?0.2g，蒸餾水1000mL，pH?7.6。

3.根據權利要求2所述的一株甘蔗鐮孢轉化人參屬植物總皂苷制備抗癌有效部位的方法，其特征在于：菌種生長于實驗中常用的馬丁氏培養基、PDA培養基。

4.根據權利要求1所述的一株甘蔗鐮孢轉化人參屬植物總皂苷制備抗癌有效部位的方法，其特征在于：通過酵解天然三七莖葉皂苷，直接獲得抗癌有效部位，且抑瘤率高達75.7%。