[發(fā)明專利]一種應用X射線滅活魚類精子遺傳物質(zhì)的方法及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710302092.9
• 申請日: 2007-12-24
• 公開（公告）號: CN101468041A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發(fā)明（設計）人: 傅洪拓;龔永生;吳滟;何新龍;熊貽偉;蔣速飛;王曉娟
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心
• 主分類號: A61K35/52
• 分類號: A61K35/52;A61K41/00;A61P15/00;A01K61/00;C12N5/06
• 代理公司: 北京萬科園知識產(chǎn)權代理有限責任公司
• 代理人: 張亞軍;夏 新

技術領域

本發(fā)明涉及一種魚類人工雌核發(fā)育的方法，特別涉及一種高效滅活魚類精子遺傳物質(zhì)的方法。

背景技術

人工誘導雌核發(fā)育是魚類遺傳育種的重要途徑之一，可以用于魚類性別控制、純系建立、無性繁殖和克隆、保護瀕危魚類、基因定位等，在遺傳學研究和新品種培育方面都有著廣泛的應用。人工誘導雌核發(fā)育包括兩個核心技術，一是在保持精子授精功能的前提下，使精子的遺傳物質(zhì)失活，二是用遺傳滅活的精子與具有正常遺傳物質(zhì)的卵子授精獲得受精卵后，進行遺傳物質(zhì)(染色體)加倍，其中如何高效滅活精子的遺傳物質(zhì)是關鍵。

可用于滅活精子遺傳物質(zhì)的方法包括X射線、γ射線、紫外線等射線照射。到目前為止，曾用X射線處理魚類精子的有R.Lasher和R.Rugh(1962)、Romashov(1963)、Golovinskaya(1963)、Stanley(1974)和Cherfas(1975)等報道；曾用γ射線處理魚類精子的有Purdom(1969)、Nagy等(1978)、Chourrout(1980，1984)和Refstie(1982)等報道；用紫外線處理魚類精子的有Nace(1970)、Chourrount(1982)、Onozato和Yamaha(1983)、Shelton(1989)、Christensen和Tiersch(1994)等報道。

紫外線具有安全、廉價和操作簡便的優(yōu)點，但由于穿透力很差，往往不能滅活全部精子，所獲得的后代魚中，除雌核發(fā)育魚外，還有正常授精的魚，干擾了結果的分析及其應用，同時紫外線滅活精子時，需要事先用稀釋液將精液進行稀釋，致使精子活力降低且存活時間縮短，誘導雌核發(fā)育的效率低且重復性較差。γ射線穿透力很強，精液不需要稀釋，對精子遺傳物質(zhì)具有很強的滅活效果，但正是由于其超強的穿透力，γ射線源需要放置在專門建造的深井中，并且需要非常嚴格的配套防護設備，費用昂貴，無法大規(guī)模推廣應用。X射線的穿透力介于γ射線和紫外線之間，精液不需要稀釋，完全能滿足滅活精子的要求，與此同時，X射線的防護相較于γ射線簡單，幾毫米厚的鉛板就能夠阻擋住，因此X射線應用于人工誘導雌核發(fā)育具有顯著的優(yōu)勢。

據(jù)文獻報道，1913年，X射線首次被應用于處理魚類精子，至上世紀80年代，X射線在魚類誘變育種方面的應用也有報道，雖發(fā)現(xiàn)X射線可用于滅活和誘變遺傳物質(zhì)，但均屬于初步的定性研究，缺乏系統(tǒng)和深入的研究，沒有確定滅活魚類精子的最佳照射條件和最佳照射劑量。特別是上世紀80年代至今，未見X射線應用于魚類研究的報道，有關研究停頓了近30年，致使X射線在魚類中的應用停滯不前。

在此背景下，本發(fā)明人對X射線的照射劑量進行了系統(tǒng)的研究，確定了滅活魚類精子的最佳照射劑量，建立了應用X射線滅活魚類精子遺傳物質(zhì)的方法，填補了近30年來X射線在魚類遺傳育種研究領域應用的空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：提供一種應用X射線滅活魚類精子遺傳物質(zhì)的方法，在保持精子授精功能的前提下，實現(xiàn)對魚類精子遺傳物質(zhì)的高效滅活。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

提供一種應用X射線滅活魚類精子遺傳物質(zhì)的方法，魚類精液量為0.5～1.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf離心管，X射線強度為100kV-5mA，照射時間為50～80分鐘，照射距離為5～15cm。

所述照射時間優(yōu)選為50～60分鐘。

所述照射時間更優(yōu)選為60分鐘。

所述照射距離優(yōu)選為10cm。

所述的滅活魚類精子遺傳物質(zhì)的方法的最優(yōu)選方案為：魚類精子量為1.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf離心管，X射線強度為100kV-5mA，照射時間為60分鐘，并且照射距離為10cm。

本發(fā)明還提供所述的應用X射線滅活魚類精子遺傳物質(zhì)方法在淡水魚類遺傳育種中的應用，所述淡水魚類為鯉魚、錦鯉或金魚等淡水魚類。

正常兩性繁殖魚類其成熟的卵子一般處于第二次成熟分裂中期，所以用遺傳失活的精子激發(fā)的卵子將發(fā)育為單倍體。選擇一個合適的X射線照射劑量使精子染色體完全失活而不影響其授精能力是得到雌核發(fā)育單倍體胚胎的關鍵。