[發明專利]一種對奇異變形桿菌的ITS特異的核苷酸及其應用

有效

• 申請號: 200710301364.3
• 申請日: 2007-12-25
• 公開（公告）號: CN101469326A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 曹勃陽;劉蕾;王磊;馮露;王敏
• 申請（專利權）人: 天津生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C07H21/00;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京連和連知識產權代理有限公司
• 代理人: 姜兆元

技術領域

本發明涉及一種對奇異變形桿菌(Proteus?mirabilis))中16S?rRNA-23SrRNA基因的間區(Internal?transcribed?spacer，以下簡稱ITS)特異的的核苷酸，特別是涉及對奇異變形桿菌中的ITS特異的寡核苷酸及其應用。

背景技術

奇異變形桿菌是一種條件致病菌，存在于人體腸道(攜帶率高達25％)和醫院環境中，可引起人的原發性和繼發性感染，如創傷感染、呼吸道感染、腹瀉、尿路感染、腹膜炎、中耳炎、乳突炎、心內膜炎、腦膜炎入敗血癥，還可引起食物中毒。奇異變形桿菌是泌尿道感染(Urinary?TractInfection，UTI)的主要致病菌，在復雜泌尿道感染(complicated?UTI)中僅次于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌(引起12％的感染)，在長期留置尿管病人的菌尿中僅次于斯氏普羅威登菌(引起15％的感染)(Rózalski?A，Sidorczyk?Z，1997)，亦是嬰兒腸炎的病原菌之一。

目前，對奇異變形桿菌主要采用常規生物化學檢測方法為主，該檢測方法容易出現過多的假陽性、假陰性現象，通常需要將待測菌株經較長時間的培養才能進行檢測，檢測操作過程復雜，檢測周期長，通常需要兩到三天才能檢測完一次待測樣品，而且需要較高的技術和設備條件，檢測成本高。因而需要發展靈敏度高、快速、簡便的檢測方法。

近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，包括轉錄間隔區(ITS)序列分析、隨機擴增長度多態性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態性(RFLP)分析等。和傳統檢測技術相比，這些基于多聚酶鏈式反應(PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強等優點。

核糖體內轉錄間隔區(ITS)，是介于16S?rRNA和23S?rRNA之間的區域，在幾乎所有細菌的基因組中都以單拷貝或多拷貝的形式存在，相對較短(200bp-1000bp)。該區域進化速率較快，具有超變位點，它的變異速率相當于16S?rRNA或者23S?rRNA的十倍左右，在種內不同菌株間高度保守，而在細菌的種間存在著豐富的變化。因此具有很高的分辨率，更易區分開進化關系很近的菌種，大大增強了檢測的特異性?？梢詾檠芯考毦南到y發育、分類鑒定和分子檢測提供豐富的遺傳信息。

聚合酶鏈式反應技術(Polymerase?chain?reaction，簡稱PCR技術)作為微生物檢測的技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需2個小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

發明內容

本發明的一個目的是提供了一種對奇異變形桿菌的ITS特異的核苷酸；

本發明的另一個目的是提供該特異核苷酸的應用，將其設計引物，通過優化和設計，提供一種用于檢測奇異變形桿菌的PCR試劑盒，并利用該PCR試劑盒檢測奇異變形桿菌的存在。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種對奇異變形桿菌的ITS特異的核苷酸，所述核苷酸包含：

a)SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列或者其互補DNA或RNA序列；

b)不同于a)但編碼的氨基酸序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列；

c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。

所述的SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的分離的核苷酸，全長分別為398和524個堿基；

上述的一種對奇異變形桿菌的ITS高度特異的核苷酸為源于ITS的寡核苷酸，具有SEQ?ID?NO：5的序列，是位于SEQ?ID?NO：1中的186至205的堿基和位于SEQ?ID?NO：2中的186至205的堿基。

上述的對奇異變形桿菌的ITS特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟：(1)基因組的提??；(2)通過PCR擴增奇異變形桿菌中的ITS基因簇；(3)構建ITS克??；(4)對ITS克隆測序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異引物的篩選。

上述的核苷酸的應用，可將所述核苷酸作為引物用于PCR試劑盒、作為探針用于雜交反應與熒光檢測，或者用于制造基因芯片或微陣列以檢測細菌。