[發(fā)明專(zhuān)利]一種耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶產(chǎn)生菌以及該耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶的基因和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710191969.1
• 申請(qǐng)日: 2007-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101215534A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何冰芳;歐陽(yáng)平凱;李霜;柏中中;姚忠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12N9/56;C12N15/57;C12P21/06;C12P41/00;C12R1/10
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所
• 代理人: 汪旭東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶產(chǎn)生菌以及其耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因，以及其在有機(jī)相中催化肽合成、拆分外消旋胺及氨基酸的應(yīng)用，屬于微生物學(xué)與酶學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白酶自1914年被試驗(yàn)用于洗滌劑的添加成分以來(lái)，由于具有重要商業(yè)用途而被廣泛關(guān)注。當(dāng)今蛋白酶的產(chǎn)量占據(jù)酶市場(chǎng)的40％以上，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、制藥、制革、診斷試劑、污水處理等領(lǐng)域。而且，據(jù)統(tǒng)計(jì)2005年后，蛋白酶的用量已大幅攀升。蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌及原核生物等所有生物中，其中微生物來(lái)源的蛋白酶占據(jù)目前蛋白酶生產(chǎn)總產(chǎn)量的2/3以上。微生物來(lái)源的蛋白酶又可根據(jù)酶的反應(yīng)pH、活性基團(tuán)的特征等分為金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等。

堿性蛋白酶(EC.3.4.21-24，99)定義為在中性至堿性pH范圍具有活性的蛋白酶，該類(lèi)酶具有絲氨酸活性中心(絲氨酸蛋白酶)或金屬活性中心(金屬蛋白酶)，其中又以堿性絲氨酸蛋白酶為具有重要商業(yè)用途的酶。絲氨酸蛋白酶通常在中性至堿性pH條件下具有活力，最佳活力時(shí)pH為7～11，該酶分子量通常較小，范圍為18～35kDa。根據(jù)該酶對(duì)氧化型胰島素β鏈的作用特異性而進(jìn)一步分類(lèi)，通常絲氨酸蛋白酶可分為胰凝乳蛋白酶類(lèi)、枯草桿菌蛋白酶類(lèi)、小麥絲氨酸羧肽酶II型蛋白酶和葡萄球菌蛋白酶等。

隨著溶劑與酶工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)酶在有機(jī)溶劑中能催化在水中的不能進(jìn)行的某些反應(yīng)。在正常水相條件下，蛋白酶催化肽鍵水解，但在水限制的介質(zhì)中能逆轉(zhuǎn)反應(yīng)而促進(jìn)肽鍵的形成。水解反應(yīng)理論上可逆，而且有關(guān)肽鍵水解的研究表明，當(dāng)采用某種機(jī)制使反應(yīng)體系中產(chǎn)物濃度低于平衡濃度時(shí)即可克服水解逆反應(yīng)的熱力學(xué)障礙，使反應(yīng)向肽合成方向進(jìn)行。化學(xué)法催化肽合成長(zhǎng)期以來(lái)在肽合成中占有重要地位，但化學(xué)法催化肽合成有明顯的缺點(diǎn)，如：1.肽鍵形成過(guò)程中的消旋作用；2.對(duì)氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)及脫保護(hù)導(dǎo)致成本增加和產(chǎn)物減少；3.酰基供體等的回收利用；4.制備用于食品級(jí)肽的過(guò)程中存在有毒有機(jī)溶劑的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

利用蛋白酶有機(jī)相催化肽合成有以下3種方式：a.含有水可溶性有機(jī)溶劑的水溶體系；b.有機(jī)-水雙相體系；c.微水含量的有機(jī)溶劑體系。在方式a中，有機(jī)溶劑在反應(yīng)體系中的含量對(duì)產(chǎn)量具有重要影響；在方式b中由于水相中的pH值易于調(diào)整以及可通過(guò)分離步驟使肽的合成能連續(xù)進(jìn)行，因此，方式b最先成功應(yīng)用于肽合成，如Aspartame^的前體物的合成。該反應(yīng)以嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)為催化劑，在雙相中合成前體二肽，含有底物(Z-L-Asp和L-PheOMe)的有機(jī)相被連續(xù)添加到反應(yīng)器中，底物被萃取到含有酶的水相中，并在水相中合成前體二肽，然后二肽再被萃取到有機(jī)相中，使反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。由于水的存在促進(jìn)了水解反應(yīng)，成為酶促肽合成中的最大弱點(diǎn)，因此體系C成為最理想的體系。

酶法拆分手性化合物是目前國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，酶催化的手性拆分技術(shù)，擁有其他拆分方法所不能比擬的眾多優(yōu)點(diǎn)，如催化活性高，耗能少對(duì)環(huán)境無(wú)污染，反應(yīng)的副產(chǎn)物少，高專(zhuān)一性和選擇性，拆分效率高等。

非天然存在的氨基酸大多為外消旋體，必須通過(guò)拆分才能得到旋光純的對(duì)映體。與合成肽不同，大多數(shù)氨基酸的外消旋體不易用化學(xué)法拆分，而用酶法拆分更簡(jiǎn)單有效。目前盡管溶劑對(duì)酶活性和立體選擇性的影響規(guī)律和機(jī)制尚不十分清楚，但是大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)改變?nèi)軇┛梢哉{(diào)節(jié)酶的活性和選擇性，改變酶的動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)，通過(guò)溶劑的改變可以顯著提高酶的催化活性和立體選擇性。在蛋白酶催化的手性拆分反應(yīng)中，尤其是在在不同類(lèi)型的有機(jī)溶劑中，耐有機(jī)溶劑蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)剛性程度不同，立體選擇性程度都有明顯的差異。

蛋白酶在水相中催化的手性反應(yīng)在許多不足之處，如水解副反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)烈；酶用量相對(duì)較多，產(chǎn)物易覆蓋在酶周?chē)斐蓴U(kuò)散限制，因此在應(yīng)用上受到限制。酶的選擇性與溶劑的介電常數(shù)及偶極矩有較好相關(guān)性，酶在非水介質(zhì)中與水中相比其分子內(nèi)具有較強(qiáng)的非共價(jià)相互作用力，從而有高度的結(jié)構(gòu)剛性。在有機(jī)溶劑中蛋白酶催化的手性拆分反應(yīng)，尤其是兩相體系中的酶法拆分有著產(chǎn)物旋光度高、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品分離提純簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且通過(guò)改變有機(jī)溶劑控制酶分子的活性部位的剛?cè)岢潭龋岣邔?duì)映體選擇性。