[發明專利]無溶劑系統中固定化全細胞酶催化生產植物甾醇酯的方法

無效

• 申請號: 200710168653.0
• 申請日: 2007-12-07
• 公開（公告）號: CN101200754A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 胡小加;陳洪;江木蘭;董緒燕;劉昌盛;魏芳;張銀波;黃鳳洪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N11/08;C12R1/845
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 黃行軍

技術領域

本發明涉及一種生產植物甾醇酯的方法。

背景技術

植物甾醇是一種具有生理功能的天然產物。許多文獻報道甾醇起到預防心血管疾病的作用，因為它能有效降低有害低密度膽固醇(LDL)的水平，但游離甾醇在水和油中的溶解度小限制了它的應用，植物甾醇在應用中存在以下問題：1)結晶形式使其在人體內的溶解性和生物可利用性比較差；2)不溶于水，在油中的溶解度也很小，給應用于食品工業帶來困難。由于植物甾醇酯具有良好的脂溶性，所以將植物甾醇與脂肪酸酯化后轉化成油溶性的植物甾醇酯，能夠解決在食品工業中應用的限制。另外由于油酸等脂肪酸本身就具有很好的生理功能，所以脂肪酸的甾醇酯則可兼具兩者的功效，降低血清膽固醇和甘油三酯效果更佳，能更好地發揮植物甾醇的生理功能。

目前植物甾醇酯一般采用化學法合成和酶法催化合成兩種方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種制作工序簡單、成本低的無溶劑系統中固定化全細胞酶催化生產植物甾醇酯的方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：無溶劑系統中固定化全細胞酶催化生產植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟：

1)固定化全細胞酶的制備：

(1)將葡枝根霉(Rhizopus?stolonifer)按常規方法配制成10²～10⁴孢子懸浮液，得葡枝根霉(Rhizopus?stolonifer)孢子懸浮液，備用；

(2)搖瓶培養基配制：按各組份所占質量百分比：全脂豆粉2.0％，菜籽油0.3～0.6％，磷酸氫二鉀1.2％，硫酸銨0.3％，硫酸鎂0.3％，磷酸二氫鈉0.4％，水95.2～95.5％；選取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和水混合，得搖瓶培養基，備用；

(3)將聚氨酯剪切成3～5mm泡沫顆粒，備用；

(4)按100ml搖瓶培養基中加1～3ml葡枝根霉(Rhizopus?stolonifer)孢子懸浮液，100ml搖瓶培養基中加聚氨酯泡沫顆粒0.3～0.5g，將葡枝根霉(Rhizopus?stolonifer)和聚氨酯在搖瓶培養基中，26～30℃條件下培養40～60h；取出長滿葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)的聚氨酯泡沫顆粒，真空干燥，得固定化全細胞酶，備用；

2)酯化：將油酸、月見草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全細胞酶，加塞后置于水浴恒溫振蕩器中在溫度40～60℃、轉速100～300r/min的條件下進行酯化反應，反應時間46～50h，得酯化后的反應產物；其中，油酸、月見草油或食用大豆油與甾醇的質量比為3～7∶1；固定化全細胞酶為下述：(1)油酸、月見草油或食用大豆油，(2)甾醇，二種質量之和的1.0～1.7％；

3)離心分離、干燥：將酯化后的反應產物離心分離，離心后的上層液為植物甾醇酯產品；離心后的固體物冷凍干燥，得固定化全細胞酶，可重復使用。

步驟3)所述的離心分離的條件是：2000～4000rpm，離心10～20min。

步驟3)所述的冷凍干燥的條件是：-10～0℃，1mbar，干燥時間3～5小時。

本發明與化學合成法相比，無溶劑全細胞酶催化合成有2個優點：1)反應選擇性高，反應過程中副產物少；2)反應條件溫和，整個生產過程在常溫下進行，可以有效避免多元不飽和脂肪酸的氧化。本發明與有機相脂肪酶合成法相比，無溶劑全細胞酶催化合成有2個優點：1)采用全細胞，免除了脂肪酶的分離、提取、純化和固定化等復雜工序，是克服目前脂肪酶生產、應用成本高的有效途徑之一；2)無溶劑體系可以在生產過程中，不需要任何有機溶劑。這不僅可以在生產工藝中免除了有機溶劑脫除，是一種綠色環保的工藝路線。有利于今后的產品開發；而且不會產生不利于消費者身體健康的殘余有機溶劑。

產生脂肪酶的生物全細胞作為催化劑(簡稱固定化全細胞酶)，即將產脂肪酶的微生物細胞固定在聚氨酯泡沫顆粒中，進行發酵培養后，收集聚氨酯泡沫顆粒，經過簡單處理后即可作為一種生物催化劑，催化脂肪酸、油脂和植物甾醇轉化生成植物甾醇酯。

本發明的有益效果是：

1)制作簡單：本發明制作工序簡單，不需要復雜設備；將供試菌株進行發酵培養后，收集固定菌體進行干燥。

2)降低成本：以固定化全細胞酶催化劑的形式利用脂肪酶，既省去了脂肪酶的分離提取、純化和固定等工序，也避免在此過程中的酶損失，節省了大量設備投資、運行費用，適用于工業化生產。