[發明專利]人腫瘤壞死因子—α的生產方法

無效

• 申請號: 200710162972.0
• 申請日: 2007-09-28
• 公開（公告）號: CN101397560A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 黃陽濱;任軍;朱飛云
• 申請（專利權）人: 上海新生源醫藥研究有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/28;C07K14/525;C12N1/19
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技術領域

本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種高效生產重組人重組人腫瘤壞死因子—α的方法，以及有關的重組人腫瘤壞死因子—α的核苷酸序列、工程細胞的構建、重組人腫瘤壞死因子—α的表達和純化工藝。

背景技術

腫瘤壞死因子(Tumor?Necrosis?Factor?alpha，TNF-α)是一類具有廣泛生物學作用的細胞因子。它是由157個氨基酸殘基組成，SDS-PAGE分子量為17，000道爾頓的蛋白質。天然TNF-α主要由激活巨噬細胞和一些細胞系如HL-60、U937等細胞所分泌。八十年代后許多實驗室已成功地克隆了TNF-α的基因，促進了TNF-α分子結構和功能的深入研究，并為TNF-α應用于臨床治療的研究提供了充足的來源。

TNF-α的主要生物學功能有：

1.抑瘤作用。大量實驗研究和臨床I和II期應用的資料初步證實了TNF-α對某些腫瘤細胞具有細胞毒和抑制生長的作用。但并不是對全部腫瘤細胞都具有抑制效應。例如人上皮癌細胞中三分之一是對TNF-α有明顯細胞毒反應，另外三分之一則表現為生長受抑制，其余三分之一對TNF-α不敏感。在人白血病細胞中對TNF-α反應最敏感的是T淋巴系白血病細胞，其次為髓系和粒系白血病細胞，對TNF-α敏感性最差的則是B淋巴系白血病細胞。一些卵巢癌、乳腺癌、骨髓瘤、肺癌、肝癌和成纖維細胞瘤等各類腫瘤細胞中對TNF-α的敏感度也有所差異。由此而知，TNF-α對腫瘤的抑瘤作用不是光譜的，而是有選擇性的。

2.TNF-α具有抑制病毒或對病毒感染的細胞具有殺傷作用。TNF-α可產生劑量依賴性的抑制病毒復制作用，它可抑制DNA類病毒如：腺病毒—2型(Ad-2)，單純皰疹型病毒II型(HSV-2)等，還抑制RNA病毒如：腦心肌炎病(EMCV)，皰疹性口炎病毒(VSV)等。TNF-α還可以對病毒感染的細胞選擇性殺傷，這可能是因為受病毒感染后的細胞對TNF-α敏感性增強。如TNF-α對EB病毒感染后的B細胞具有明顯的細胞毒作用。TNF-α還具有抑制牛百姓白血病病毒(BLV)的作用。

3.TNF-α對多核中性粒細胞有激活作用。TNF-α可以促進多核中性粒細胞的吞噬功能，同時使多核中性粒細胞介導的抗體依賴補體細胞毒(ADCC)作用明顯增強，致使對腫瘤細胞或者病毒感染細胞的殺傷效應增強。

4.TNF-α參與機體免疫調節。由于TNF-α本身是一類具有廣泛生物學效應的細胞因子，它的產生和釋放及水平的變化直接或間接地影響著其它細胞因子和效應因子的狀態和功能。對腫瘤細胞產生細胞毒或抑制作用的TNF-α劑量足以導致GM—CSF、IL—1、IL-2和各類激素及小分子炎癥物質的分泌，從而引起一系列復雜的連鎖生物學效應。TNF-α在免疫系統中具有增強抗原誘導T細胞增殖的作用，刺激T細胞克隆的生長，增強HLA-DR抗原的表達，同時也可以是激活T細胞表面IL-2受體表達水平增加。有人還認為TNF-α與器官移植中的移植物抗宿主病(GVHD)有著密切的關系，用抗TNF-α的抗體預防器官移植中的GVHD的發生將有益的。

在TNF-α的眾多生物學功能中，它的抑瘤作用倍受人們的關注。1984年，TNF的cDNA克隆成功，其基因工程產品已試用于臨床。但一個突出的問題是TNF-α在體內的半衰期短，低劑量注射抗瘤效果不顯著。要達到療效水平，需持續大劑量注射，又遠遠超過了人的耐受劑量，這往往會引起發熱、寒戰、疲勞、頭痛、休克等全身癥狀，臨床應用效果不理想，因而限制了臨床上的廣泛應用。為提高TNF-α的抗腫瘤活性，消除或降低其毒副作用，盡快將TNF-α應用于臨床，國內外科學家進行了不懈的努力。目前制備新型TNF-α的研究，一方面是在對hTNF2α結構與功能關系的研究基礎上，對TNF-α分子進行結構改造，獲得TNF-α的衍生物；另一方面是將TNF-α同另一個能與靶細胞專一性結合的蛋白質或肽融合，構建融合蛋白，以增加其在靶細胞部位的濃度，從而起到增加療效、減少毒副作用的效果。

具有生物活性的TNF-α其空間結構是3個TNF-α單體以邊對面形式形成的近似三角錐形的三聚體，結構與功能研究表明，刪去N端前7個氨基酸殘基不影響TNF-α三聚體空間結構。在刪去N端7個氨基酸殘基的同時增加N端的堿性氨基酸，可以增強形成活性三聚體的能力，從而提高TNF-α的抗腫瘤活性。另外，研究表明增加C端的疏水性氨基酸可以提高TNF-α的抗瘤活性。基于TNF-α結構與功能的關系，國內外研究者對TNF-α的N端、C端的結構基因進行了各種定點突變，并獲得了許多新型有效的TNF-α衍生物。