[發(fā)明專利]一種高通量克隆微生物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710099676.0
• 申請日: 2007-05-28
• 公開（公告）號: CN101092629A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊禮富;王真輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科大華誼專利代理事務(wù)所
• 代理人: 呂中強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及一種高通量克隆微生物Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的方法。

背景技術(shù)：

在國際上，大腸桿菌缺陷株K被用來從微生物中克隆Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。其通常做法是：提取純培養(yǎng)微生物的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行部分酶切，將酶切片段連接到載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌缺陷株K。然后，在含一定濃度NaCl或LiCl的固體培養(yǎng)基上對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，從而獲得攜帶Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的重組子。采用上述方法，已經(jīng)從微生物中克隆得到了10余種類型的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并對其中部分基因的功能特性進(jìn)行了研究。由于環(huán)境中99％以上的微生物無法通過現(xiàn)有方法得到純培養(yǎng)，因此，利用已有技術(shù)獲得微生物Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的數(shù)量有限，極大地限制了對微生物Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的挖掘和利用。為了加速對微生物Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能基因資源的認(rèn)識和挖掘，需要發(fā)展高通量的目的基因篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是從環(huán)境微生物中高通量、規(guī)模化克隆Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因資源，用于深入研究微生物輸出鈉離子的分子機(jī)制，以及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因耐鹽作物和微生物，進(jìn)而充分開發(fā)和利用鹽堿地。

一種高通量克隆微生物Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的方法，經(jīng)過樣品采集、宏基因組DNA的粗提、宏基因組DNA的純化三個(gè)步驟，再通過陽性克隆的篩選、測序和目的基因的亞克隆與再轉(zhuǎn)化，獲得Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白單一基因或基因簇，并對基因進(jìn)行功能鑒定。其特征是：

1.樣品采集

從鹽湖、鹽堿湖和鹽堿地等多元化的地域環(huán)境中采集土壤樣品，樣品采集后，-70℃--80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.采用CTAB-SDS-凍融法粗提宏基因組DNA

宏基因組DNA是指特定環(huán)境樣品中所有微小生物的DNA總和。CTAB-SDS-凍融法(即十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉-凍融法)粗提宏基因組DNA的詳細(xì)步驟為：

(1)稱取1g土樣于15mL離心管中(如果需要大量提取宏基因組DNA，可稱取3-10g土樣于50mL離心管中，相應(yīng)試劑的用量按比例增加)，加入2-10mL經(jīng)35-37℃預(yù)熱的DNA提取液、50-200mg?PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)、10-100μL(約20-200個(gè)活性單位)溶菌酶和5-20粒滅菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min條件下振蕩30-90min。然后加入0.2-1.0mL濃度為20％的SDS(十二烷基硫酸鈉)，上下用力顛倒，使之混勻；

DNA提取液的配方包括：100mmol/LTris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)，100mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/LNa3?PO4(磷酸三鈉)，1.5mol/LNaCl，濃度為1-3％CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，pH7.8-8.2。

(2)50-65℃水浴1-2小時(shí)(每隔10-30min上下輕輕顛倒離心管2-4次，切勿振蕩！！)。水浴完畢，冷卻至室溫，然后加5-50μL(約10-100個(gè)活性單位)蛋白酶K，35-37℃溫度下?lián)u動(dòng)30-60min；

(3)置于-20℃冷凍20min-40min，然后50-65℃凍融、35-37℃溫育30-60min；0-10℃、8000-12000r/min離心5-20min，得到上清1和沉淀物1；

(4)將得到的上清1轉(zhuǎn)移至另一離心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL?DNA提取液和0.1-0.3mL?20％SDS，混勻，50-65℃水浴1-2小時(shí)。然后于-20℃冷凍，50-65℃解凍，冰浴冷卻；

再冷凍和融化各1次，0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清2；

將所得到的上清2吸出，并與上清1合并，所得上清液為上清3；