[發明專利]一種高通量克隆微生物Na+/H+逆向轉運蛋白基因的方法

無效

• 申請號: 200710099676.0
• 申請日: 2007-05-28
• 公開（公告）號: CN101092629A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發明（設計）人: 楊禮富;王真輝
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科大華誼專利代理事務所
• 代理人: 呂中強

1.一種高通量克隆微生物Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白基因的方法，經過樣品采集、宏基因組DNA的粗提、宏基因組DNA的純化三個步驟，再通過陽性克隆的篩選、測序、目的基因的亞克隆和再轉化操作，獲得Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白單一基因或者基因簇，并對目的基因進行功能鑒定，其特征是土壤樣品來自高鹽環境，樣品采集后保存溫度為-70℃--80℃；提取宏基因組DNA的詳細步驟為：

(1)稱取1g土樣于15mL離心管中，加入2-10mL經過35-37℃預熱的DNA提取液和50-200mgPVPP及10-100μL溶菌酶和5-20粒滅菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min條件下振蕩30-90min，加入0.2-1.0mL濃度為20％的SDS，10-100μL溶菌酶-合20-200個活性單位；

DNA提取液的配方包括：100mmol/L?Tris-HCl，100mmol/L?EDTA，100mmol/L?Na3PO4，1.5mol/L?NaCl，濃度為1-3％CTAB，pH7.8-8.2；

(2)50-65℃水浴1-2小時，每隔10-30min上下顛倒離心管；水浴完畢，冷卻至室溫，然后加5-50μL蛋白酶K，35-37℃溫度下搖動30-60min，5-50μL蛋白酶K-合10-100個活性單位；

(3)置于-20℃冷凍20min-40min，然后50-65℃凍融、35-37℃溫育30-60min；0-10℃、8000-12?000r/min離心5-20min，得到上清1和沉淀物1；

(4)將得到的上清1轉移至另一離心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL?DNA提取液和0.1-0.3mL?20％SDS，混勻，50-65℃水浴1-2小時，然后于-20℃冷凍，50-65℃解凍，冰浴冷卻；

重復冷凍和融化1次，0-10℃、8000-12?000r/min離心5-20min，得到上清2；

將所得到的上清2吸出，并與上清1合并，所得上清液為上清3；

(5)抽提：向上清3中加入與上清3等體積預冷的氯仿∶異戊醇，氯仿與異戊醇體積比為24∶1，上下顛倒離心管，然后0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清4；

吸取上清液4至另一離心管，加入體積相當于上清液4的0.1倍的預冷的pH＝5.2的1mM?EDTA-3M?NaAc和體積相當于上清液4的0.6倍的預冷的異丙醇，混勻后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小時使DNA沉淀；0-10℃、8,000-12,000r/min離心5-20min，得到上清5和沉淀物2；

(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL經0-10℃預冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min離心10-20min，得到上清6和沉淀物3；

(7)去上清6，用真空干燥機對沉淀物3進行干燥后，向所得粉末狀宏基因組DNA中加入20-150μL滅菌ddH₂O，-20℃保存備用；

對于大量提取宏基因組DNA，則土樣的稱取數量和相應試劑的用量要按比例增加。