[發明專利]西尼羅病毒的引物和探針及一步法實時RT－PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 200710092783.0
• 申請日: 2007-09-29
• 公開（公告）號: CN101245394A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 謝鵬;曾志磊;陳曉
• 申請（專利權）人: 謝鵬;曾志磊
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明專利屬于生物技術領域，涉及科研、臨床和病毒流行病學監測等工作中使用RT-PCR方法對西尼羅病毒RNA的檢測和定量分析。具體是針對西尼羅病毒的引物和探針及一步法實時RT-PCR檢測試劑盒。

背景技術

西尼羅病毒與人類疾病

西尼羅病毒(West?Nile?Virus，WNV)病是一種烈性人畜共患疾病，1937年在烏干達北部尼羅河地區首先發現而得名。近年來西尼羅病毒感染在歐洲、中東、西亞和俄羅斯等地區和國家頻頻發生，成為近年來影響美國最大的傳染病。西尼羅病毒是經庫蚊等嗜鳥蚊傳播，以鳥類為主要動物宿主的黃病毒。人、馬和其他哺乳動物在被西尼羅病毒感染的蚊蟲叮咬后而發病，輕者出現發熱、頭痛等流感樣癥狀(西尼羅熱)，重者可表現為中樞神經系統癥狀(西尼羅腦炎)，甚至死亡。

西尼羅病毒的檢測

西尼羅病毒的檢測方法主要有以下幾種：病毒分離與鑒定、血清中和試驗(Serum?neutralization?test，SNT)、酶聯免疫吸附檢測(Enzyme-linkedimmunosorbent?assays，ELISA)、PCR檢測等。

病毒分離是病毒性腦炎最基礎、最重要的診斷手段。對于新發疾病病例，病毒分離是最有價值的工作，但西尼羅病毒分離需在生物安全4級(P4)條件下進行。血清中和試驗(Serum?neutralization?test，SNT)和酶聯免疫吸附檢測(Enzyme-linked?immunosorbent?assays，ELISA)均為免疫學檢測方法，敏感性高，但特異性較差，并存在一定的交叉反應。制備單克隆抗體可以增加特異性，但成本較高。PCR檢測具有快速、準確的特點，也被廣泛用于對西尼羅病毒的檢測。目前已經建立的PCR檢測方法有：1)Sonja?Linke等【Linke，S，Ellerbrok?H，Niedrig?M，et?al.Detection?of?West?Nile?virus?lineages?1?and?2?by?real-timePCR，J.Virol.Methods(2007)，doi：10.1016/j.jviromet.2007.05.021】針對5’非編碼區(UTR)的實時PCR(Taqman熒光探針)檢測方法，檢測靈敏度能達10⁶～10^-1plasmid?copies/assay，該方法適合西尼羅病毒的診斷和流行病學研究。2)Jiménez-Clavero?MA等【Jiménez-Clavero?MA，Agüero?M，Rojo?G，et?al.A?newfluorogenic?real-time?RT-PCR?assay?for?detection?of?lineage?1?and?lineage2?West?Nile?viruses.J.Vet.Diagn.Invest，2006，18(5)：459-62】用TaqManMGB探針對西尼羅病毒進行了實時RT-PCR檢測，敏感性可達10^-2～10^-3pfu/tube。

實時PCR(Real-time?PCR)技術

實時PCR技術是近年來發展起來的一種新型的PCR技術，它是在傳統PCR反應體系的基礎上添加了熒光染料或具有熒光標記的探針，將熒光信號強弱與PCR擴增情況結合在一起，通過監測PCR反應管內熒光信號的變化來實時觀測PCR反應進行的情況。實時PCR技術，解決了傳統PCR難以對擴增起始模板的量進行測定的難題，避免了傳統檢測技術樣本消耗量大，實驗操作繁瑣，檢測靈敏度低等缺點，并具有快速、避免交叉污染等特點，可以在基因檢測、基因表達、SNP分析等領域廣泛應用。而TaqMan探針的采用，更增加了檢測的特異性和結果的可靠性，是一種方便、快捷、經濟的檢測方法，尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學監測等工作。