[發明專利]家蠶絲腺特異表達的HLH轉錄調控因子BmHLH1

無效

• 申請號: 200710092546.4
• 申請日: 2007-08-07
• 公開（公告）號: CN101139601A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 趙萍;劉春;徐漢福;夏慶友;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自于家蠶絲腺特異表達的轉錄調控因子。

背景技術

絲腺是家蠶唯一能生產繭絲的器官，是整個蠶絲業的生物學基礎，一頭家蠶一般經過25d左右的生長發育，在幼蟲期食下鮮桑葉約22g，合成并分泌0.5～1g的絲蛋白，特別是在5齡中、后期，家蠶能夠以驚人的效率將桑葉蛋白轉變成絲蛋白。它合成蛋白質的能力和效率，是迄今為止發現的所有生物組織器官中最強最高的一種。根據合成蛋白質的初步推測，這種高效率的蛋白質合成，不但需要眾多基因的相互協調，而且基因的表達，大多數都具有高度的組織和時期特異性。家蠶只在其5齡中期后期，絲膠基因于中部絲腺大量表達合成絲膠蛋白，絲素基因(Fib-H，Fib-L，P25)在后部絲腺特異表達合成表達絲素蛋白。研究發現，絲蛋白基因的特異表達是受絲腺組織一些特異的轉錄調控因子調控，同時一些泛在的轉錄調控因子也協作參與這一過程。根據絲腺中與蠶絲基因轉錄有關的轉錄因子的特性、細胞分別、結合位置以及它們在蠶絲基因表達調節中的作用將轉錄因子分為兩類，一種是組織特異因子，如SGF-1、SGF-2、SGF-B和PSGF。另一種是泛在的共同因子，包括SGF-3、SGF-4、TRIO、UB2a、UB2b及BMFA、FBF-A1。

家蠶絲腺高效合成絲蛋白的一個重要的生物學基礎就是家蠶絲腺細胞特殊的分裂方式——細胞不分裂，核分裂。家蠶絲腺起源于外胚層的器官，絲腺細胞僅在胚胎期發生10次細胞分裂，產生約2000個絲腺細胞，目前研究發現多絲量品種的家蠶絲腺細胞比少絲量品種多；幼蟲期，絲腺細胞不再發生分裂，細胞數不再增加，只發生細胞的肥大生長，，細胞核在細胞內只發生核的復制和分裂。在家蠶5齡后期的一個絲腺細胞，核內DNA的復制次數可以達到29～30次，少絲量蠶品種約復制29次，多絲量蠶品種約復制30次。家蠶絲腺細胞數的多少及細胞核的復制次數都與家蠶的產絲量緊密相關，而對于家蠶絲腺細胞產生及細胞核復制分裂的理論研究目前還比較少，也還沒有找到相關的調控因子。因此，發現與家蠶絲腺細胞分化和控制細胞分裂的調控因子對于提高家蠶產絲量，改善蠶絲品質，促進我國蠶絲產業興隆方面具有重要的意義。

發明內容

本發明將家蠶絲腺組織基因的特異表達調控研究和家蠶絲腺的應用研究相結合，其目的在于提供一類來自于家蠶絲腺的特異表達的含HLH結構域的新型的轉錄調控因子。該類型的轉錄調控因子對胚胎期器官的特異化，細胞分裂及基因的特異表達有重要的調控作用，對于家蠶絲腺的理論研究和產業應用有重要的應用價值。

本發明申請人對絲腺基因的表達譜進行了分析，結果發現一個絲腺特異表達的轉錄調控因子，并對其氨基酸序列分析發現此基因具有HLH結構域且能與DNA序列特異結合，基因命名為BmHLH1。在家蠶絲腺轉錄調控因子研究方面，已報道的絲腺特異的轉錄調控因子中大部分為含homeodomain的轉錄調控因子，本研究以前尚未發現含HLH結構域的轉錄調控因子。通過熒光定量PCR實驗，證實BmHLH1僅在家蠶絲腺特異表達，因此認為BmHLH1為家蠶絲腺組織特異表達的新型轉錄調控因子。目前對HLH結構域的轉錄調控因子的研究表明，它們對胚胎器組織器官的特異化和細胞分裂等有重要的調控作用；同時，果蠅的唾液腺的研究結果表明一個含HLH結構域名為Sage的基因對唾液腺基因的特異表達有重要調控作用，而編號為BmHLH1的基因通過分析發現就是果蠅Sage基因的同源基因。因此，BmHLH1基因對絲腺組織的特化和細胞分裂及基因的特異表達有重要調控作用。

本發明申請人進行了HLH基因克隆，具體方法如下：

(1)基因芯片制作及雜交：共設計22987條探針，探針包含了家蠶全部預測基因和部分EST序列所代表的轉錄物，將探針以點陣(微陣列)的形式排布在醛基片上；提取家蠶大造品種5齡3天的不同組織的RNA并經純化后與探針雜交；

(2)芯片數據分析：首先對總體的熒光強度值進行矯正，使各張芯片的總熒光強度接近該批次芯片總熒光強度的平均值；采用Lowess方法進行芯片內數據的歸一化處理；以絲腺芯片數據為分析對象，首先對數據進行過濾，選取實驗重復數據半數以上信號強度大于400的探針進行分析；絲腺特異表達基因的篩選在絲腺表達基因中進行篩選，以絲腺組織信號強度大于任一非絲腺組織信號強度2倍以上，且p＜0.01的探針為分析對象；通過對家蠶5齡3天不同組織表達芯片的分析，獲得在家蠶絲腺特異表達的含HLH結構域的轉錄調控因子，其對應的蛋白質序列編號為BmHLH1；