[發明專利]家蠶先天免疫信號途徑中的bmimd基因

無效

• 申請號: 200710092539.4
• 申請日: 2007-08-07
• 公開（公告）號: CN101139596A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 程廷才;夏慶友;劉春;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及來自家蠶先天免疫信號傳遞途徑中的一個關鍵基因bmimd基因。

背景技術

免疫機制的研究是一個漫長而困難的過程。現代分子生物學及遺傳學等先進技術為研究提供了有力的工具。昆蟲受到不同的微生物感染時，能誘導不同的抗菌肽基因表達，而這些抗菌肽基因的表達主要受兩種信號轉導途徑的調控，即Toll途徑和Imd途徑。這兩種途徑通過激活不同的轉錄因子來調控不同的抗菌肽基因表達。Imd(immune?deficiency)，最初發現該基因的突變會引起果蠅對革蘭氏陰性菌失去抵抗能力，是目前所知能改變編碼抗菌肽基因、具有被微生物誘導性的第一個突變。Imd途徑就是以該基因命名的，是該信號途徑中的關鍵基因。

經過研究，果蠅imd基因編碼一個30kd的蛋白，含有一個致死結構域，該結構域與哺乳動物RIP(TNF-受體相互作用蛋白)極其相似。Imd蛋白包含一個80-aa的c-末端致死結構域和一個173-aa的N-末端區域，后者與其它蛋白沒有多大的同源性。C-末端部分包含一個致死結構域，并能與其它致死結構域蛋白如FADD相互作用，FADD是在下游信號傳遞中所需要的，并且也是受體復合物的一部分。

致死結構域蛋白Imd作用于遺傳學定義的細胞內信號級聯反應最頂部，位于跨膜蛋白PGRP-LC的下游，該級聯反應激活Relish轉錄因子。通過實驗證明，PGRP-LC與Imd能形成復合物。果蠅Imd和PGRP-LC突變體在抗菌肽的反應方面具有非常相似的作用。Imd突變體和PGRP-LC突變體在沒有血細胞的時候也能對膿病毒引起的創傷做出反應。Imd也在表皮發揮作用，允許在本地對膿病毒形成的創傷做出應答。Philippe?Georgel等人進一步研究還發現imd基因控制Diptericin(雙翅肽)、Drosocin(果蠅肽)、Cecropins(天蠶素)、Attacins(樗蠶素)等抗菌肽的分泌表達。

果蠅imd突變體的發現，為研究該基因的功能提供了便利。雖然該基因在果蠅中的研究較深入，但在其它物種中幾乎未見報道。

發明內容

本發明申請人將比較基因組學研究與基因功能研究相結合，其目的在于提供一種家蠶imd基因，進一步研究確定bmimd基因在家蠶體液免疫信號傳遞途徑中行使的功能：是否能與家蠶跨膜蛋白PGRP-LC形成復合物、能否控制抗菌肽的表達、具體控制了哪些抗菌肽的表達和該基因的突變對家蠶抗微生物侵染有何影響，進而尋找在家蠶中是否具有該基因的突變體存在。bmimd基因在免疫信號傳遞途徑中功能的確立，在理論上將為鱗翅目昆蟲的先天免疫應答機制的闡述提供數據支撐，在產業上將為家蠶抗性的品系的鑒定研究提供參考。

本發明申請人通過對家蠶imd基因進行生物信息學研究、獲得了bmimd基因的全長cDNA序列，進而對該基因進行克隆、體外表達及表達蛋白純化、抗體制備和基因干涉等。具體方法如下：

(1)生物信息學研究：從美國國立生物技術信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載果蠅imd基因的序列；該序列與家蠶EST數據庫進行BLASTN檢索，挑選比對較好序列，用DNAstar軟件進行序列拼接延伸，經迭代檢索到不能延伸為止，最后得到一條長度為1092bp的重疊群；預測基因的外顯子、內含子結構采用sim4程序(http://gamay.univ2perp.fr/analyse?seq/sim4)；預測結構域采用SMART軟件(http://smart.embl2heidelberg.de/)；預測分子量、等電點采用Expasy網站(http://ca.expasy.org/tools/)；

(2)Bmimd的克隆及測序驗證：用Trizol提取RNA，M-MLV反轉錄為cDNA；用引物F5’gccggatccGGCCACTTTAAAAACAAAG?3’(BamH?I酶切位點)和R5’cgcctcgagTTAGTTTTTTTCAGAGTAC?3’(XhoI酶切位點)PCR擴增、回收，連接目的片段到PMD18-T載體；挑選陽性克隆經酶切驗證后送到上海生物工程公司測序；該克隆命名為imd/PMD18-T；