[發明專利]綿羊多頭蚴病特異性基因及其分離與鑒定

無效

• 申請號: 200710089252.6
• 申請日: 2007-03-16
• 公開（公告）號: CN101070539A
• 公開（公告）日: 2007-11-14
• 發明（設計）人: 由弘;張文寶;張壯志;石保新;吐爾洪·依米提;王進成
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/63;C12N1/21;C12Q1/68
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所
• 代理人: 張莉

技術領域

本發明涉及一種綿羊多頭蚴病新基因的克隆、表達及初步的免疫性試驗，更具體說，涉及從綿羊多頭蚴病總RNA中分離1個新的基因，利用基因工程的方法在高效大腸桿菌表達系統表達并純化出具有免疫原性的重組蛋白，它可有效激起動物機體的免疫反應，其抗血清可以識別自然蟲體(成蟲和幼蟲)抗原的特異性蛋白。

背景技術

多頭蚴病(俗稱腦包蟲)是由多頭絳蟲(Multiceps?multiceps)引起的人獸共患寄生蟲病。成蟲主要寄生于終末宿主家犬的小腸內，狼、狐等肉食動物也有感染。家畜羊、牛、豬和人等中間宿主誤食蟲卵后，卵移行至大腦、延髓、脊髓，發育成包囊，表現中樞神經受損癥狀，死亡率為80-100％。人偶有感染，蟲體寄生于腦、皮下肌肉和眼內。此病在西北牧區感染率較高且牛羊并行感染，新疆綿羊多頭蚴病歷年的平均發病率為1-2％，死亡率為100％，平均每年因該病就死亡數十萬只羊。新疆局部地區如伊犁地區感染率達5％，塔里木河南岸墾區感染率達5.7％，哈密地區感染率為4％，在西藏綿羊感染率高達0.9-22.85％。嚴重危害人畜健康，對畜牧業生產造成很大的經濟損失。研制有效的疫苗作為預防該病的有力“武器”實屬刻不容緩。

羊絳蟲(Taenia?ovis)基因工程疫苗(45W)的問世為寄生蟲病疫苗的研制掀開了具有歷史意義的篇章。此后，Lightowlers等用高免六鉤蚴的羊血清在細粒棘球絳蟲(Echinococcus?granulosus)六鉤蚴cDNA文庫中篩選獲得陽性克隆Eg95，其重組蛋白(16.5KD)對羊抗細粒棘球絳蟲感染的免疫保護可達到96-98％。Charles等從多房棘球蚴(Echinococcus?alveolaris)中獲得Eg95的同源基因EM95，將其重組蛋白運用于小鼠免疫實驗，證實EM95的免疫保護率可達63.1-82.9％。目前國際上已成功研制出羊絳蟲、細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、牛帶絳蟲(Taenia?saginata)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)的基因工程疫苗，對中間宿主可產生很高的免疫。有趣的是不同絳蟲的保護性抗原的特異性基因堿基序列具有很大的同源性，在大腸桿菌中經誘導表達后，重組蛋白的生物學功能也非常相似。雖然這些保護性重組蛋白的生物功能及其免疫學作用機制有待于進一步的研究，但這為其它帶科絳蟲特異性抗原基因的分離提供了理論依據。

對于多頭絳蟲特異性基因的分離研究在國內外很少有人涉及。文獻查新顯示，目前國際刊物發表的有關多頭蚴病的文章僅有72篇，主要偏重于多頭蚴病的流行病學、生化組織形態學、運用分子生物學手段與其它絳蟲進行區別鑒定、分離脂蛋白抗原作為診斷抗原的研究等方面。我課題組于1991年在國內首次報道利用多頭絳蟲的六鉤蚴或六鉤蚴的分泌代謝抗原免疫綿羊，可以取得85-100％的保護，Verster等也證實了這一點。但這種抗原不可能依靠培養六鉤蚴的途徑工業化生產，只能通過重組基因疫苗的方法，關鍵是尋找保護性抗原基因，為多頭蚴病疫苗的研制奠定基礎。

本發明通過對多種絳蟲保護性基因的綜合分析，設計出多種絳蟲保護性基因共有的引物，運用RT-PCR法，從多頭蚴cDNA中擴增出可能具有保護性的基因片斷，將其命名為45m，其長度為698bp，編碼232個氨基酸。這段基因未在genebank中發表，是新發現的多頭蚴病的新基因。經同源性比較得，45m蛋白與羊絳蟲的45W蛋白的同源性為89％，與牛帶絳蟲保護性抗原的同源性為85％。將45m基因利用基因工程的方法在高效大腸桿菌表達系統表達并進行純化，該重組蛋白可有效激起動物機體的免疫反應，其抗血清可以識別自然蟲體(成蟲和幼蟲)抗原的特異性蛋白。45m重組蛋白有可能成為候選疫苗。

發明內容

本發明的目的在于，研究綿羊多頭蚴病特異性基因及其分離與鑒定，通過對畜間多種絳蟲病保護性基因的綜合分析，設計引物，用RT-PCR的方法，綿羊多頭蚴病的幼蟲階段分離到新基因，將其命名為45m，其長度為698bp，編碼232個氨基酸。這段基因未在genebank中發表，是新發現的多頭蚴病的新基因。該基因和羊絳蟲、牛帶絳蟲的保護性基因片斷具有很高的同源性。所表達的蛋白質分子量約為6,300道爾頓。將45m克隆到pET41b表達載體中，構建符合讀碼框的融合基因，表達量可達100-120mg/L。將該蛋白用于綿羊的免疫試驗中，可有效激起機體的免疫反應，其抗血清可以與成蟲和幼蟲抗原總蛋白在63KD處發生特異性反應。