[發(fā)明專利]一種用于檢測Ⅱ型豬圓環(huán)病毒核苷酸片段的引物和探針序列

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710074191.6
• 申請日: 2007-05-08
• 公開（公告）號: CN101294223A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡傳偉;肖性龍;吳斌;賈赟;張經(jīng)緯;李葉;李振榮
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳太太基因工程有限公司;中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測II型豬圓環(huán)病毒核苷酸片段的引物和探針序列。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒(porcine?circovirus，以下簡稱PCV)為無囊膜的單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，病毒粒子直徑約17-20nm，是迄今已知最小的動物病毒之一。PCV屬圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，根據(jù)其抗原性及基因組成不同，分為2種基因型或稱血清型，即I型PCV(簡稱PCV1)及II型PCV(簡稱PCV2)。PCV1是1974年首次從豬傳代細胞系PK-15中作為一種污染物分離出來的病毒，動物實驗表明該病毒無致病性，廣泛存在于正常豬體內(nèi)各組織器官。而PCV2與近年來發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning?multisystemicwasting?syndrome，PMWS)密切相關(guān)。該疾病的發(fā)生和蔓延已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病以漸進性消瘦、呼吸困難、淋巴結(jié)腫大、發(fā)育障礙及皮膚蒼白等為主要特征。然而這些癥狀并不是PCV2感染后所特有的，其它許多病原感染也可引起類似的癥狀，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)感染，因此必須采用合適的檢測方法來確定這些癥狀是否與PCV2感染有關(guān)。

隨著對PCV2研究的深入，越來越多的資料表明，PCV2與豬群中發(fā)生的許多疾病密切相關(guān)，包括PMWS、豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙、A2型先天性震顫、豬呼吸道病復(fù)合征以及豬增生性和壞死性肺炎等。

目前，對PCV2常用的檢測方法有病毒分離，間接免疫熒光抗體法(IFA)、E11SA、原位核酸雜交(ISH)、免疫組織化學(xué)法(IHC)和PCR等。病毒分離是實驗室確診PCV-2感染最靈敏的方法，但由于PCV2在PKI5細胞上不產(chǎn)生病變，病毒分離耗時長且難度大。原位雜交雖然有很高的靈敏度，但操作煩瑣，成本較高，周期長，并且對病料的要求較高。E11SA靈敏度高，但結(jié)果判斷易受主觀因素的影響，目前廣泛應(yīng)用的常規(guī)PCR檢測方法簡單快速，靈敏，但容易出現(xiàn)交叉污染，容易產(chǎn)生假陽性，而且由于PCV2的廣泛存在，而臨床發(fā)病與隱性感染的豬群中病毒量又存在明顯的不同，常規(guī)PCR很難起到實時定量檢測的作用。因此，建立一種更加快速、準(zhǔn)確、操作簡便檢測方法勢在必行。

實時定量PCR是近年來發(fā)展很快的一種檢測方法，它是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在擴增反應(yīng)體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點外，它還具有以下優(yōu)點：(1)特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實時監(jiān)測熒光，無須PCR其PCR擴增和產(chǎn)物分析的全過程均在單管封閉條件下進行，實現(xiàn)了擴增產(chǎn)物的實時動態(tài)檢測和結(jié)果自動分析，避免了對擴增產(chǎn)物的后處理，有效地避免了實驗室交叉污染，同時可在較短的時間內(nèi)得到結(jié)果。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴增的對數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠。(4)可實現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計針對性內(nèi)標(biāo)，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)?；?、自動化及聯(lián)網(wǎng)管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何病毒的核酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測II型豬圓環(huán)病毒核苷酸片段的引物和探針序列。

基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

用于檢測II型豬圓環(huán)病毒核苷酸片段的引物和探針序列包括：由上游引物PCV?II?pf517序列為AAATCTCATCATGTCCACCGC和下游引物PCV?II?pr615序列為GCTACCGTTGGAGAAGGAAAA組成的引物對。探針PCV?II?pb585序列為TTCAACACCCGCCTCTCCCGCA。