[發(fā)明專利]多靶點miRNA反義核苷酸技術(shù)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710072024.8
• 申請日: 2007-04-11
• 公開（公告）號: CN101121934A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊寶峰;王志國;呂延杰;白云龍;初文峰
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué);王志國
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C07H21/02;A61K31/7088
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 榮玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種反義核苷酸技術(shù)。?

背景技術(shù)

反義核苷酸是一段與mRNA或DNA特異性配對結(jié)合從而阻斷其基因表達的人工合成的RNA或DNA分子。反義核苷酸能通過封閉或抑制腫瘤細胞和病毒的關(guān)鍵編碼基因來特異性抑制細胞增殖和病毒的復(fù)制，是治療腫瘤、病毒性疾病和其它相關(guān)疾病的新型藥物。目前正在進行研究的反義核苷酸藥物有10余種，其中抗腫瘤作用的有7種，抗病毒作用的1種，其它如作用于心血管、代謝、免疫及細胞粘附系統(tǒng)的有4種。疾病的發(fā)生，往往是幾個或多個基因綜合作用的結(jié)果，目前這些反義核苷酸藥物設(shè)計均是針對某個單一致病基因或某個調(diào)節(jié)病毒基因蛋白表達(酶)的關(guān)鍵序列來設(shè)計的。微RNAs(miRNAs)的發(fā)現(xiàn)改變了我們對調(diào)節(jié)基因表達機制的理解。根據(jù)miRNAs在基因組中的數(shù)量(預(yù)計在人類基因中含量＞1％，調(diào)節(jié)1～10％的基因)和表達水平(一些miRNAs在每個細胞中的拷貝數(shù)＞1000)說明miRNAs在人體內(nèi)是一種含量豐富的RNA種類。而且每個miRNA具有調(diào)節(jié)數(shù)百個mRNAs的潛能；因此miRNAs在細胞中有廣泛的功能。目前已證明包括癌癥在內(nèi)的一系列人類疾病中miRNAs是這些疾病新的治療靶點。因此，沉默miRNAs最有效的途徑是利用miRNA的反義核苷酸。根據(jù)疾病中miRNAs功能變化針對性的設(shè)計反義核苷酸藥物進行干預(yù)，這是在miRNAs研究和miRNAs治療中一種基本的途徑。這些miRNA反義核苷酸的結(jié)合具有特異性、劑量依賴性，有效性和不可逆性。這個方法已被用來鑒定miRNAs的許多細胞學(xué)功能，且人們已經(jīng)相信它是治療疾病的一種合理的對策。目前沉默miRNAs的主要方法為Anti-miRNA反義抑制劑(Anti-miRNA?antisense?inhibitors?or?anti-miRNA?oligonucleotides，AMO)方法，但該方法存在靶向性單一，作用效力差的問題。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有沉默miRNAs的方法存在靶向性單一，作用效力差的問題，而提出了多靶點miRNA反義核苷酸的制備方法。多靶點miRNA反?義核苷酸的制備方法通過以下方法實現(xiàn)：一、通過基因芯片篩選或文獻提供，找到可調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的miRNA；二、根據(jù)所選定的多個靶miRNA，人工合成所選定靶miRNA各自的反義核苷酸鏈，稱為反義單元；三、將不同的靶miRNA的反義單元設(shè)計到一個能同時沉默多個靶miRNAs的單條核苷酸序列中，即用一條八個核苷酸的鏈來連接兩個不同目標(biāo)miRNA的反義單元，其中八個核苷酸的鏈的兩端分別連接于兩個不同的目標(biāo)miRNA的反義單元的5’端和3’端，反義單元兩端的五個核苷酸由亞甲基橋鎖定，八個核苷酸的鏈為CTTAAATG，即實現(xiàn)多靶點miRNA反義核苷酸的方法。本發(fā)明將針對不同miRNA為靶標(biāo)的多個反義核苷酸整合到單一核苷酸片段中，這種片段對miRNAs具有多靶向性——復(fù)合miRNAs(combined?anti-miRNA?oligonucleotides，CAMO)，它是尋找miRNAs靶點和研究miRNAs功能的一種改良途徑，這主要是由于CAMO的“單片段-多靶點”方法可以是攜帶重復(fù)的同一反義單元的同型體或者是攜帶多種靶向不同miRNA的反義單元的異型體。由于一個特定的mRNA被多種miRNA調(diào)節(jié)，為了獲得基因的最佳干擾效果需要同時靶向多種miRNA，而本發(fā)明可以做到這一點，這是CAMO方法優(yōu)于AMO方法之處。由于不同目的需要多種不同反義單元集合的組合，CAMO為此提供了一個具有創(chuàng)新和理性設(shè)計的方法，為確認和鑒別miRNA的靶點和它們在基因調(diào)控過程中的作用等功能分析中提供了一種精密的工具。本發(fā)明可以作為一種簡單而直接的方法，可對其它包含多種miRNA及多種基因的生物過程進行研究。CAMO方法與現(xiàn)有方法相比較其最大優(yōu)勢在于，可以使一個藥物分子調(diào)節(jié)多個靶向基因，作用效果更加顯著，解決了現(xiàn)有方法靶向性單一，作用效力差的問題。?

附圖說明