[發(fā)明專利]馬鈴薯微型薯的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710071705.2
• 申請日: 2007-01-30
• 公開（公告）號: CN101233824A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘆翠華;邸宏;石瑛
• 申請（專利權(quán)）人: 蘆翠華;邸宏;石瑛
• 主分類號: A01H1/06
• 分類號: A01H1/06;A01H4/00;C12N15/82;C12N15/87;C12N5/04;A01G1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特指一種馬鈴薯微型薯的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

在全世界所有的糧食作物中，馬鈴薯的總產(chǎn)量排名第四，僅次于玉米、水稻和小麥，具有生育期短、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營養(yǎng)全面、產(chǎn)業(yè)鏈長等特點(diǎn)，因此越來越受到全世界的廣泛重視。由于馬鈴薯普通栽培種是同源四倍體，遺傳組成的復(fù)雜性及遺傳背景的狹窄是制約馬鈴薯育種發(fā)展的主要因素，常規(guī)育種進(jìn)展緩慢。

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破不同種屬，甚至不同生物之間基因交流的障礙，突破了遠(yuǎn)緣雜交不親和的阻礙，豐富了抗源基因，且有可控性強(qiáng)，育種周期短，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，從而為馬鈴薯育種開辟了新途徑。

在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因操作中，目前較常用且轉(zhuǎn)化效率較高的是農(nóng)桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)介導(dǎo)法。自從1983年第一例農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯問世以來(Ooma?G.等)，已有許多實(shí)驗(yàn)表明用農(nóng)桿菌侵染法可以獲得正常的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已日趨成熟，但還沒有完全程序化。

目前使用多種馬鈴薯外植體進(jìn)行的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化包括莖段、葉片、薯塊、下胚軸、子葉、愈傷組織、試管薯、原生質(zhì)體等，均已獲得成功(Kawchu等，1991；Lawson等，1992；Filho等，1994；Gulina等，1994；Farran等，2002)。

但仍存在諸多問題亟待解決。很多研究顯示，針對不同的基因型、不同的外植體，馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化效率有顯著差異(Herman等，1989；De?Block等，1988；Dale等，1995；王春林，1990)。

多數(shù)遺傳轉(zhuǎn)化由于程序復(fù)雜，先經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)，再進(jìn)行分化誘導(dǎo)出抗性芽，最后進(jìn)行生根培養(yǎng)得到完整植株，周期較長，一般為5-8周，且轉(zhuǎn)化頻率多低于20％(Vi?s?ser等，1989；Trugillo，2001；Beaujean?A.等，1998)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種馬鈴薯微型薯的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過建立一個(gè)適合多種馬鈴薯品種的微型薯轉(zhuǎn)基因體系，該體系經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑直接分化出抗性芽，經(jīng)生根誘導(dǎo)后獲得完整再生植株，轉(zhuǎn)化頻率均為50％以上，達(dá)到利用馬鈴薯微型薯為轉(zhuǎn)化受體，建立一個(gè)高效適應(yīng)性廣的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的目的。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種馬鈴薯微型薯的遺傳轉(zhuǎn)化方法，它包括以下步驟：

(1)馬鈴薯微型薯的誘導(dǎo)

取脫毒試管苗，經(jīng)過煉苗后，從培養(yǎng)基中連根拔出，移栽于溫室，經(jīng)過60-80d的生長，微型薯達(dá)到2-5g重，即可收獲，晾干后保存；

(2)菌株的活化及菌種的準(zhǔn)備

取低溫甘油保存的農(nóng)桿菌，涂布于固體Yeast?Extract?Peptone培養(yǎng)基上，28℃下倒置暗培養(yǎng)，使其活化；3d后挑取單菌落接種于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L鏈霉素的Yeast?Extract?Peptone液體培養(yǎng)基中，28℃下160rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜；取700μl該菌液接種于70ml相同的Yeast?Extract?Peptone液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)14-18h后，將達(dá)到對數(shù)生長期的菌液置于離心管，4000rpm離心5min，棄去上清，重懸于Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基，稀釋至OD值0.5-0.8；

(3)侵染和共培養(yǎng)

取收獲后打破休眠的脫毒微型薯，在無菌條件下用70％的酒精浸泡30s、0.1％的升汞浸泡10min、無菌水清洗5次后，去皮切成厚度為1mm的薄片，用制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染薯塊5min，然后用無菌濾紙將多余菌液吸去，接種于含有3.0mg/L玉米素和1.0mg/L吲哚乙酸的Murashige和Skoog培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)2d，培養(yǎng)條件為溫度24℃，黑暗；

(4)轉(zhuǎn)基因植株再生培養(yǎng)

將共培養(yǎng)后的微型薯薯塊用無菌水清洗2-3次，接種于含有玉米素、吲哚乙酸、進(jìn)口頭孢噻肟鈉和卡那霉素的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中進(jìn)行植株再生培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃，光照強(qiáng)度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；在再生培養(yǎng)基中經(jīng)過45d的培養(yǎng)后，將產(chǎn)生的健壯綠色叢生芽切下，轉(zhuǎn)移至添加頭孢噻肟鈉和卡那霉素的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，使其形成完整的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株，培養(yǎng)條件為溫度24℃，光照強(qiáng)度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；

(5)轉(zhuǎn)基因植株的檢測