[發明專利]馬鈴薯微型薯的高效遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200710071705.2
• 申請日: 2007-01-30
• 公開（公告）號: CN101233824A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 蘆翠華;邸宏;石瑛
• 申請（專利權）人: 蘆翠華;邸宏;石瑛
• 主分類號: A01H1/06
• 分類號: A01H1/06;A01H4/00;C12N15/82;C12N15/87;C12N5/04;A01G1/00
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1.?一種利用馬鈴薯微型薯的高效遺傳轉化方法，其特征在于：

(1)馬鈴薯微型薯的誘導

取脫毒試管苗，經過煉苗后，從培養基中連根拔出，移栽于溫室，經過60-80d的生長，微型薯達到2-5g重，即可收獲，晾干后保存；

(2)菌株的活化及菌種的準備

取低溫甘油保存的農桿菌，涂布于固體Yeast?Extract?Peptone培養基上，28℃下倒置暗培養，使其活化；3d后挑取單菌落接種于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L鏈霉素的Yeast?Extract?Peptone液體培養基中，28℃下160rpm/min振蕩培養過夜；取700μl該菌液接種于70ml相同的Yeast?Extract?Peptone液體培養基中，振蕩培養14-18h后，將達到對數生長期的菌液置于離心管，4000rpm離心5min，棄去上清，重懸于Murashige和Skoog液體培養基，稀釋至OD值0.5-0.8；

(3)侵染和共培養

取收獲后打破休眠的脫毒微型薯，在無菌條件下用70％的酒精浸泡30s、0.1％的升汞浸泡10min、無菌水清洗5次后，去皮切成厚度為1mm的薄片，用制備好的農桿菌菌液侵染薯塊5min，然后用無菌濾紙將多余菌液吸去，接種于含有3.0mg/L玉米素和1.0mg/L吲哚乙酸的Murashige和Skoog培養基上，共培養2d，培養條件為溫度24℃，黑暗；

(4)轉基因植株再生培養

將共培養后的微型薯薯塊用無菌水清洗2-3次，接種于含有玉米素、吲哚乙酸、進口頭孢噻肟鈉和卡那霉素的Murashige和Skoog培養基中進行植株再生培養，培養條件為24℃，光照強度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；在再生培養基中經過45d的培養后，將產生的健壯綠色叢生芽切下，轉移至添加頭孢噻肟鈉和卡那霉素的Murashige和Skoog培養基中進行生根誘導，使其形成完整的馬鈴薯轉基因植株，培養條件為溫度24℃，光照強度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；

(5)轉基因植株的檢測

采用PCR、Southern雜交及生物學方法鑒別再生植株，最終獲得馬鈴薯轉基因植株。

2.?根據權利要求1所述的利用馬鈴薯微型薯進行高效遺傳轉化的方法，其特征在于：該步驟(1)的脫毒試管苗生長15-20d時進行移栽

3.?根據權利要求1所述的利用馬鈴薯微型薯進行高效遺傳轉化的方法，其特征在于：該步驟(2)的農桿菌選用LBA4404或EHA101。

4.?根據權利要求1所述的利用馬鈴薯微型薯進行高效遺傳轉化的方法，其特征在于：該步驟(3)要求使用的馬鈴薯微型薯打破休眠時間為3個月。

5.?根據權利要求1所述的利用馬鈴薯微型薯進行高效遺傳轉化的方法，其特征在于：該步驟(4)添加的頭孢噻肟鈉的濃度為150mg/L，卡那霉素的濃度為50mg/L，玉米素的濃度為3.0mg/L，吲哚乙酸的濃度為1.0mg/L。

6.?根據權利要求1所述的利用馬鈴薯微型薯進行高效遺傳轉化的方法，其特征在于：在根癌農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化中，利用微型薯為轉化受體，通過體細胞胚胎發生途徑直接分化抗性芽。