[發明專利]腫瘤靶向性腺相關病毒載體的構建和應用

無效

• 申請號: 200710071560.6
• 申請日: 2007-10-09
• 公開（公告）號: CN101173299A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 王毅剛;黃芳;張義玲;姜永厚;錢程;劉新垣
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 唐銀益

技術領域

本發明屬于生物技術和基因治療領域，具體地說，是涉及一種特異性在腫瘤細胞內表達的靶向性腺相關病毒載體rAAV-hTERT-hTRAIL及其構建方法和應用。

背景技術

對于大多數種類的癌癥，目前仍然采用的是傳統療法如外科手術、放療、化療等，而面對很多中晚期惡性腫瘤，傳統療法顯得束手無策，主要表現在治愈率低、復發率及死亡率高、預后較差。基因治療是通過改造基因來治療疾病的一種生物高技術方案，人們對腫瘤的基因治療寄寓極高的熱情，66％的基因治療臨床試驗均用于腫瘤治療。到目前為止，腫瘤的基因治療研究已取得了重要進展；對于惡性腫瘤，基因治療可利用腫瘤細胞與正常細胞間分子水平的差異，顯著拓寬腫瘤的“治療窗”，能高效地、選擇性地殺傷腫瘤細胞或阻止腫瘤細胞生長以及防止腫瘤的轉移。

然而經過十多年600多個臨床試驗方案發現，盡管基因治療是非常安全的，但其抗腫瘤效應卻非常低，有的甚至無任何治療作用，這主要是現階段基因治療載體的問題。目前的載體系統在人體內既不能特異性地轉染所有的腫瘤細胞，也不能使治療基因在腫瘤內高效表達，而且腫瘤的發生是包含多種基因改變的多步驟過程，通過單一基因的修飾很難徹底消滅腫瘤。這一系列問題嚴重阻礙著腫瘤基因治療的臨床療效。因此研制高效、靶向轉染腫瘤細胞的載體系統對目前腫瘤的基因治療至關重要。

在目前被廣泛應用的基因治療載體中，病毒載體包括腺病毒(adenovirus，Ad)、腺相關病毒(adeno-associated?virus，AAV)、逆轉錄病毒(retrovirus)和慢病毒(lentivirus)等最為常用。AAV由于具備以下特性而引人注目。第一，AAV引起的免疫反應輕微，病源性低，至今未有報道其引起人類任何疾病；第二，作為一種缺陷型病毒，在無輔助病毒感染時，只能整合在宿主細胞DNA中，呈“潛伏”感染狀態；第三，可定點整合，AAV是唯一一種以位點特異性方式整合在人19號染色體上的真核病毒，從而避免隨機整合而導致宿主細胞突變的潛在危險性；第四，宿主范圍廣，包括分裂期細胞和非分裂期細胞；第五，攜帶的外源基因可長期、穩定表達。因此，AAV成為目前基因轉移最為理想的載體之一。然而，由于AAV2廣泛的宿主范圍和組織或細胞特異性的缺乏，使得其作為載體用于臨床前和臨床治療試驗時依然存在安全性、靶向性和轉染效率低的弊端。因此，在AAV2成功用于腫瘤治療的研究中，為了達到最大腫瘤殺傷效率和最小的細胞毒性，必須盡力克服這些問題，尋求AAV2載體介導腫瘤治療的最佳靶向策略。

近來，以病毒治療惡性腫瘤成了科學研究的熱點，且取得了新的突破。最近臨床實驗使用的幾種病毒，如腺病毒ONYX-015、CV706，單純皰疹病毒G207和G1716以及逆轉錄病毒和腺相關病毒等，治療效果令人鼓舞。這些病毒有的能夠選擇性的在腫瘤細胞中復制、增殖，殺死腫瘤細胞，釋放出來的子代病毒擴散到臨近的腫瘤細胞，在腫瘤組織內引起一種鏈式反應，最終消滅全部腫瘤，而在正常細胞中不復制；有的進入體內后能夠使介導的治療基因特異性的在腫瘤細胞內表達，而在正常細胞中不表達；還有的病毒自身蛋白具有阻止腫瘤細胞周期進行、抑制腫瘤細胞增殖及防止腫瘤發生的作用。

實施腫瘤的靶向性基因治療，首先要構建能夠介導治療基因特異性的在腫瘤細胞中表達、而對正常細胞無損害的病毒。因此，需要對腺相關病毒載體進行改造，利用腫瘤特異性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因，從而使治療基因只在腫瘤細胞內特異性表達，而對正常細胞無損害；從而提高基因治療的靶向性和療效，使腺相關病毒載體能更有效安全的應用于臨床。

利用腫瘤特異性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因是構建腫瘤靶向性腺相關病毒的方法之一，其能使治療基因只能在腫瘤細胞內表達，而在正常細胞中不表達，從而大大降低了腫瘤基因治療的副反應而增強了其靶向性和療效。近年研究表明，端粒酶可能是迄今發現的一個最為廣泛的腫瘤新標志物，在細胞永生化和腫瘤發生發展過程中起重要作用。在生理條件下，正常細胞大都沒有端粒酶活性；而在85-90％左右的腫瘤細胞中端粒酶活性高。并且其活性高低與腫瘤的惡性程度相關，提示端粒酶可以作為腫瘤治療的很好的靶點。端粒酶逆轉錄酶，即hTERT(human?telomerase?reverse?transcriptase)，是端粒酶復合物的核心成分，其表達狀態與端粒酶活性顯著相關，是細胞調控端粒酶活性的關鍵環節。hTERT基因的表達主要是從轉錄水平上調節，在90％左右的腫瘤細胞中轉錄上調，而在靜息期細胞中不轉錄。因此，hTERT啟動子被用來控制外源基因的表達，可望提高腫瘤基因治療的靶向性。