[發(fā)明專利]近江牡蠣類立克次體內(nèi)類外膜蛋白的全序列及其亞單位疫苗的制備

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710067877.2
• 申請日: 2007-04-06
• 公開（公告）號: CN101219214A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳信忠;朱保建
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K31/00;C12N15/09;C12N15/11;C12N15/31;C12N15/63
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陳禎祥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及近江牡蠣類立克次體中一種類外膜蛋白(即類ompH外膜蛋白)的全序列及其亞單位疫苗的實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)，本發(fā)明的類ompH外膜蛋白可以用于制備類外膜蛋白亞單位疫苗。

背景技術(shù)

牡蠣為重要的經(jīng)濟(jì)貝類和海水養(yǎng)殖品種。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)的數(shù)字顯示，我國每年牡蠣的產(chǎn)量具全世界首位，達(dá)到300萬噸(濕重)，占我國海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量(約1000萬噸)的約三分之一。但是海洋環(huán)境的污染、惡化和海洋病害的頻發(fā)危及到牡蠣產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近江牡蠣體內(nèi)寄生的類立克次體是引起近江牡蠣大規(guī)模死亡的重要病原微生物，目前還沒有有效的治療措施。類立克次體外膜蛋白具有抗原活性，是抗體的主要作用對象。但由于現(xiàn)有技術(shù)中未能獲得ompH外膜蛋的全序列，沒有表達(dá)載體，故難以制備出這種類立克次體中具有抗原性的類ompH外膜蛋白亞單位疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是利用基因工程技術(shù)制備近江牡蠣類立克次體中具有抗原性的類ompH外膜蛋白亞單位疫苗。以防治近江牡蠣體內(nèi)寄生的類立克次體，預(yù)防近江牡蠣大規(guī)模死亡。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，首先將近江牡蠣類立克次體的類ompH外膜蛋白的基因片段插入克隆和表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞中，進(jìn)行體外原核表達(dá)，重組蛋白純化，以純化的重組蛋白制備疫苗。

本發(fā)明關(guān)于近江牡蠣類立克次體內(nèi)類外膜蛋白亞單位疫苗的制備方法，包括以下步驟：

1、以近江牡蠣類立克次體特有的基因組DNA為模板，本申請首次設(shè)計(jì)擴(kuò)增類ompH外膜蛋白基因的引物，并首次獲得編碼類ompH外膜蛋白的基因全序列；

2、利用生物技術(shù)手段將類ompH外膜蛋白的基因片段克隆到合適的pGEM-T?easy載體中，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的大腸桿菌TG?I宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)載體pET-28a(+)-ompH；

3、類ompH外膜蛋白的體外表達(dá)，Western-blot，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法鑒定目的蛋白；

4、利用親和柱分離純化重組表達(dá)的蛋白制成亞單位疫苗。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)

制備得到的這種類外膜蛋白亞單位疫苗具有特異性強(qiáng)、免疫原性好、高度安全性等特點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

1.引物設(shè)計(jì)與合成

設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增類ompH外膜蛋白基因的寡聚核苷酸引物為：

SEQNO1

PF：5’GTGAAAAAGTGGTTATTAGCTG??3’

PR：5’TTATTTAACCTGTTTCAGTACG??3’

(此引物為本申請首次設(shè)計(jì))

2.PCR擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建

以近江牡蠣類立克次體基因組DNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃5min；35個(gè)循環(huán)：94℃30s，55℃35s，72℃35s；72℃1min。PCR產(chǎn)物連入pGEM-T?easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG?I，涂布LBA篩選平板，挑若干個(gè)克隆進(jìn)行酶切和PCR鑒定，選一陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以堿法抽提質(zhì)粒.將制備好的質(zhì)粒以BamH?I和Xho?I限制性內(nèi)切酶雙酶切，連入經(jīng)過同樣雙酶切的pET-28a(+)載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG?I。PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體pET-28a(+)-ompH。經(jīng)上述研究獲得：

1、來自于近江牡蠣類立克次體內(nèi)特有的類ompH外膜蛋白的核酸全序列如下

(在現(xiàn)有技術(shù)中未曾報(bào)導(dǎo)過)：

SEQNO2

GTGAAAAAGT?GGTTATTAGC?TGCAGGTCTC?GGTTTAGCAA?TGGCTGCTTC

AGCTGGCGTT?CAGGCAGCAG?ATAAGATCGC?TGTCGTTAAC?GTCTCCAGCA

TTTTCCAACA?GCTGCCGGCC?CGCGAAGCGG?TCGCTAAACA?GCTGGAAAAC

GAGTTTAAAG?GCCGTGCAAG?CGAACTCCAG?AACATGGAAC?GTAGCCTGCA

GACCAAAATG?CAACGTCTGC?AGCGTGACGG?CGCTACCATG?AAAGCGAGCG

ACCGCAGCAA?GTTGGAAAAA?GACGTGATGG?AGCAACGCGA?GCAGTTCTCT

CAGAAAGCCC?TGGCTTTCGA?GCAGGACAAC?CGCCGTCGCC?AGATGGAAGA