[發明專利]巨細胞病毒特異性細胞免疫應答體外檢測模型

無效

• 申請號: 200710063900.0
• 申請日: 2007-02-15
• 公開（公告）號: CN101246166A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 王延軍;孫斌;武志明
• 申請（專利權）人: 王延軍;孫斌;武志明
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

該發明涉及一種能在體外檢測巨細胞病毒(CMV)特異性細胞免疫應答的模型，該模型不僅可以方便地在體外檢測患者的巨細胞病毒特異性細胞免疫應答，而且可以篩選新型藥物。

背景技術

近年來，科學家們紛紛致力于開發新的抗CMV藥物，以期抑制病毒引起的免疫病理損傷。新藥療效的檢測，首先需要建立一CMV特異性免疫應答體外檢測模型，但目前國內外就此尚未見相關報道。將經典的CMV實驗室株感染人成纖維母細胞為抗原遞呈細胞，流式細胞儀檢測細胞因子及HLA分子表達的方法，分析該病毒株感染的細胞誘導免疫應答的能力，研究發現感染細胞表面MHC?I類分子表達明顯降低，未能檢測到病毒特異性的細胞免疫應答，因此并不適宜作為檢測模型。

發明內容

為排除MHC?I類分子表達降低而對抗原遞呈的影響，本發明建立一種以CMV突變株感染人成纖維母細胞為抗原遞呈細胞，刺激淋巴細胞，采用流式細胞儀檢測細胞內IFN-γ表達的方法，建立一在體外檢測CMV特異性細胞免疫應答的模型；該突變體基因組缺失了一段抑制主要組織相容性復合體I類分子表達的基因序列US11、US12，不影響MHC?I類分子的表達，故不影響細胞對病毒特異性抗原的遞呈。

具體實施方式：

一.CMV感染人成纖維母細胞刺激外周血淋巴細胞：將人成纖維母細胞接種于24孔細胞培養板中，每孔加入2ml?DMEM培養基，細胞長成單層，鋪滿全孔，按照1∶1的比例(數量比)，加入CMV突變株病毒液，37℃感染1小時，棄掉游離的病毒液，加入2ml?DMEM細胞培養基，在37℃、5％CO₂的孵箱中孵育48小時，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，之后加入2×10⁶外周血淋巴細胞，孵育2小時后，加入10μg/ml高爾基體抑制劑Brefeldin?A，繼續培養4h。

二.細胞內細胞因子標記法檢測IFN-γ：培養結束后，收集細胞，PBS洗滌一次，將細胞重懸于含0.02％EDTA的PBS溶液中，37℃孵育15分鐘，離心，PBS洗滌一次，將細胞重懸于紅細胞裂解液中室溫避光孵育10分鐘，洗滌、重懸細胞；加入破膜劑室溫避光反應20分鐘，PBS洗滌一次，加入鼠抗人CD8-APC、CD3-PerCP和IFN-γ-FITC抗體4℃避光標記30分鐘，PBS洗滌一次后，重懸細胞，在流式細胞儀上進行檢測，分析受到CMV感染細胞的刺激時，淋巴細胞產生IFN-γ作為CMV特異性免疫應答的指標。

本發明的有益效果是，能在體外檢測患者的巨細胞病毒特異性的細胞免疫應答；若在該體系中加入待檢的新藥，即可檢測其對細胞免疫應答的影響，從而篩選新藥。