[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因PA2950及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710060185.5
• 申請日: 2007-12-26
• 公開（公告）號: CN101195827A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 喬明強;白芳;白艷玲;張秀明;徐海津;李迎麗
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;A61P31/04
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 侯力

【技術(shù)領(lǐng)域】：本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因PA2950。

【背景技術(shù)】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)屬假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，它是一種分布廣泛的條件致病菌，在臨床上，它能引起菌血病、耳、眼、皮膚及軟組織、骨及關(guān)節(jié)、心內(nèi)膜和呼吸系統(tǒng)等的感染，是人類的三大致病菌一，是引起肺炎的首要致病菌。由于其具有形成生物被膜等多重耐藥機制，耐藥率高，常在臨床上引起頑固性、難治性感染，成為臨床治療的棘手問題。

銅綠假單胞菌具有單端鞭毛，運動活潑。鞭毛作為主要的運動器官，對銅綠假單胞菌提高營養(yǎng)物質(zhì)的獲得，逃避毒性物質(zhì)，轉(zhuǎn)移到合適的寄主，找到合適的固著位點和向環(huán)境擴散傳播起著重要作用。生物被膜降低了藥物的通透性，與耐藥性緊密相關(guān)，在生物被膜的形成過程中，鞭毛的運動對最初的固著與擴散過程起著至關(guān)重要的作用。對銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因進行研究，確定各基因的功能，為揭示其鞭毛運動機理和鞭毛在生物被膜形成中、在自然界傳播中作用的機理提供基礎(chǔ)，為臨床治療和耐藥防治提供理論依據(jù)。

有關(guān)銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因的功能研究，國內(nèi)尚無報道，國外研究對此方面有一定的涉及，其研究主要是在控制鞭毛數(shù)目基因、調(diào)節(jié)鞭毛蛋白合成的調(diào)節(jié)因子等方面，但對于鞭毛運動相關(guān)基因的功能、各基因間如何調(diào)節(jié)表達(dá)尚存在不少疑點，缺少系統(tǒng)的研究。本研究從這一點出發(fā)，探索與鞭毛運動相關(guān)基因的功能，闡明其運動相關(guān)基因之間的作用機理。

【發(fā)明內(nèi)容】：本發(fā)明目的是提供銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因PA2950，并用該基因為新藥靶點研制抑制銅綠假單胞菌的新型藥物。

本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因PA2950，其核苷酸序列如序列表所示，其基因長度為1197bp，位于銅綠假單胞菌基因組282節(jié)3309411-3310607。

上述的銅綠假單胞菌鞭毛運動相關(guān)基因PA2950可以用于以該基因為新藥靶點設(shè)計并制備抗菌藥物，以及在食品衛(wèi)生和耐藥防治方面的應(yīng)用。

本發(fā)明基因PA2950的獲得方法：使用人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)(一種基于噬菌體Mu轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座技術(shù))，造成銅綠假單胞菌基因突變，建立突變子文庫。篩選泳動能力喪失的突變子，使用Bam?HI酶切基因組DNA，酶切片段與pUC18載體連接，通過電轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，用卡那霉素和氨芐青霉素雙抗LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，測定突變株中插入片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)Mu插入的基因，確定此基因與銅綠假單胞菌鞭毛運動有相關(guān)性。

本發(fā)明的有益效果：

實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的基因PA2950缺失或失活后，能夠使鞭毛介導(dǎo)的泳動能力喪失。

Mu插入失活的基因泳動能力喪失，說明此基因與銅綠假單胞菌鞭毛的運動有關(guān)，這對鞭毛運動相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)以及揭示新基因的功能都有指導(dǎo)意義。

通過本發(fā)明，可以針對PA2950基因設(shè)計藥物，限制其正常表達(dá)，使得細(xì)菌無法通過鞭毛運動形成生物被膜，降低其耐藥性，達(dá)到治療銅綠假單胞菌引起的感染的目的。

【附圖說明】：

圖1是泳動能力喪失的陽性轉(zhuǎn)化子的蹭動運動檢測圖，其中，1、野生型PA68作為陽性對照，2、PA2950::Mu?PA68突變株。

圖2是Mu克隆子酶切產(chǎn)物電泳圖，1、DL15000?2、質(zhì)粒3、質(zhì)粒酶切。

圖3是Mu轉(zhuǎn)座子PCR產(chǎn)物電泳圖(用PCR方法檢測轉(zhuǎn)化子的Mu轉(zhuǎn)座子)，其中，4、DL2000，5、Mu克隆子PCR產(chǎn)物。

用Mu-kam?P1和Mu-kam?P2作為引物，克隆子質(zhì)粒DNA為模板，可以擴增出700bp的特異性片段，說明所檢測的克隆子質(zhì)粒中攜帶著插入了Mu轉(zhuǎn)座子的基因片段。

【具體實施方式】：

實施例1：使用Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)進行突變子文庫的建立

(1)將臨床分離株銅綠假單胞菌PA68接種于50ml?L-broth培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉5g/LNaCl)中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。

(2)次日按1∶100接種至200mlL-broth培養(yǎng)基中，200rpm，37℃培養(yǎng)至OD₅₄₀≈0.5，終止培養(yǎng)。

(3)于2℃?7000g離心10min，收集菌體。

(4)依次用等體積、1/2體積、1/5體積在冰浴中預(yù)冷的300mM蔗糖溶液重新懸浮、洗滌菌體，2℃8000g離心10min，倒凈殘液。