[發明專利]多拷貝牛肉風味肽表達基因及載體和重組畢赤酵母的構建有效

申請號：	200710059633.X	申請日：	2007-09-18
公開（公告）號：	CN101148669A	公開（公告）日：	2008-03-26
發明（設計）人：	王艷萍;邢海鵬;高文	申請（專利權）人：	天津春發食品配料有限公司;天津科技大學
主分類號：	C12N15/12	分類號：	C12N15/12;C12N15/69;C12N1/19;C12N15/66;C12R1/84
代理公司：	天津佳盟知識產權代理有限公司	代理人：	侯力
地址：	300300天***	國省代碼：	天津;12
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摘要：
搜索關鍵詞：	拷貝牛肉風味表達基因載體重組酵母構建
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種分子生物學技術構建重組DNA以在畢赤酵母發酵液中獲得牛肉風味肽(Beefy?Meaty?Peptide，BMP)的方法。

背景技術

牛肉風味強化肽(BMP)最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到，其一級結構為：Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala。BMP與食鹽、MSG有較好的協同呈味的作用，并且具有很好的熱穩定性，適合于食品工業生產中的熱處理要求。因此，BMP有望代替MSG成為新一代風味強化劑，具有廣闊的市場前景。

目前，風味肽大部分是經過蛋白質的酶解而形成的，但會產生大量副產物；此外，在蛋白質酶水解時會形成苦味肽，這嚴重限制了蛋白質水解物的利用。化學合成法也是合成小分子肽的有效方法，但其本身具有下述缺點：①消旋化和副反應；②需要對肽側鏈中的基因進行保護，尤其是固相合成時；③需過量的鏈接試劑和酰基載體；④鏈接試劑的毒性殘留影響制品和環境。

隨著分子生物學技術的發展，利用重組DNA技術改造微生物使其合成分泌所需蛋白已經成為一種經濟的生產方式。

巴斯德畢赤酵母外源基因表達系統是近年來發展的一種優秀的真核表達系統，與傳統的大腸桿菌和釀酒酵母表達體系相比，其具有的諸多優勢使之研究價值及應用價值不斷體現。其最大特點是維持代謝低，能進行高密度發酵。自20世紀70年代以來，巴斯德畢赤酵母作為單細胞蛋白生產菌的高密度發酵方法已經相當成熟，經發酵后細胞干重可高達160g/L，而且有研究表明，發酵生產的菌體含量和外源蛋白的表達水平具有一定的正比關系。畢赤酵母對外源蛋白的翻譯后加工(糖基化、二硫鍵的形成、折疊)和高等真核生物非常相似，使得外源蛋白能夠形成正確的空間構象，不但使表達的蛋白具有很好的生物活性，而且對蛋白的分泌十分有利。外源基因的整合非常穩定是此表達系統的另一個特點。畢赤酵母的生長和對外源蛋白的表達可以在廉價的合成培養基中進行，另外畢赤酵母自身的分泌蛋白很少，有資料表明，分泌的外源蛋白可以占總分泌蛋白的30％以上。因此，十分有利于分泌蛋白的純化。

發明內容

本發明的目的之一在于克服上述現有技術之不足，提供一種含有多拷貝牛肉風味肽表達基因的重組質粒載體及構建方法。

本發明的目的之二是提供一種由上述表達載體導入畢赤酵母構成的工程菌株。

本發明的目的之三是提供上述工程菌株在制備多串聯拷貝的牛肉風味肽中的應用。

為了實現本發明的目的，首先按照畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性設計出含有4拷貝BMP的表達基因片段，該片段合成的雙鏈插入到常見的載體上，通過體外連接構建成含多拷貝BMP表達基因，通過相應限制性酶切位點整合入適當的表達載體(pPIC9)，再導入畢赤酵母構成重組DNA，使其表達多串聯拷貝的BMP。

本發明目的產物BMP表達基因的獲得是根據畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性自行設計并由大連寶生物公司負責合成的。其中，4拷貝牛肉風味肽(Beefy?Meaty?Peptide，BMP)的表達基因片段，如序列表序列1所示；16拷貝牛肉風味肽的表達基因片段，如序列表序列2所示。

其中，4拷貝BMP的表達基因設計方法如下：

第一、按照畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性設計出含有4拷貝BMP的表達基因片段，4拷貝的BMP表達基因頭尾相連，每個表達片段之間不含其他序列；

第二、在上步4拷貝BMP表達基因的上游位置加入Xho?I限制性酶切位點，下游位置加入Sal?I限制性酶切位點；

第三、在上步的基因片段的Xho?I限制性酶切位點的上游位置加入EcoR?I限制性酶切位點，Sal?I限制性酶切位點的下游位置順序加入6His編碼基因、Not?I限制性酶切位點和TAA終止密碼子，最終得到如序列表序列1所示含有4拷貝BMP的表達基因片段。

16拷貝BMP的表達基因構建方法為：

第一、用Xho?I或Sal?I將以上合成構建的4拷貝BMP表達基因的載體酶切后線性化，產生粘性末端；