[發(fā)明專利]多拷貝牛肉風味肽表達基因及載體和重組畢赤酵母的構建

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710059633.X
• 申請日: 2007-09-18
• 公開（公告）號: CN101148669A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 王艷萍;邢海鵬;高文
• 申請（專利權）人: 天津春發(fā)食品配料有限公司;天津科技大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/69;C12N1/19;C12N15/66;C12R1/84
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯力

1.一種含有4拷貝牛肉風味肽BMP的表達基因片段，其基因序列如序列表序列1所示。

2.根據權利要求1所述的表達基因片段，其特征是所述的表達基因片段是以4拷貝牛肉風味肽為基本單元，進行體外連接后得到的具有牛肉風味肽的多拷貝數N的表達基因片段，拷貝數N為4的整數倍。

3.根據權利要求2所述的表達基因片段，其特征是所述的表達基因片段的牛肉風味肽的拷貝數為N＝16，其基因序列如序列表序列2所示。

4.一種表達載體，其特征是含有權利要求3所述的拷貝數為N＝16的表達基因片段的表達載體pPIC9。

5.一種工程菌株，其特征在于是用權利要求4所述的表達載體pPIC9導入畢赤酵母構成的工程菌株，菌種命名為巴氏畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115-16BMP，保藏編號為No.2136。

6.一種權利要求1所述的表達基因片段的設計方法，其特征是該設計方法的步驟如下：

第一、按照畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性設計出含有4拷貝BMP的表達基因片段，4拷貝的BMP表達基因頭尾相連，每個表達片段之間不含其他序列；

第二、在上步4拷貝BMP表達基因的上游位置加入Xho?I限制性酶切位點，下游位置加入Sal?I限制性酶切位點；

第三、在上步的基因片段的Xho?I限制性酶切位點的上游位置加入EcoR?I限制性酶切位點，Sal?I限制性酶切位點的下游位置順序加入6His編碼基因、Not?I限制性酶切位點和TAA終止密碼子，最終得到如序列表序列1所示的含有4拷貝BMP的表達基因片段。

7.一種權利要求3所述的表達基因片段的構建方法，其特征是該構建方法的步驟如下：

第一、用Xho?I或Sal?I將權利要求6所述的表達基因片段的載體酶切后線性化，產生粘性末端；

第二、用Xho?I和Sal?I將權利要求6所述的表達基因片段的載體雙酶切后回收包含4拷貝BMP、兩端含有Xho?I和Sal?I粘性末端的小片段；

第三、將第一步和第二步得到的基因片段通過T4?DNA連接酶進行連接，連接獲得含有8拷貝、12拷貝、16拷貝或拷貝數為4的任意整數倍的BMP表達基因載體；

第四、由于連接反應沒有正反向選擇，需要人為地通過用Xho?I和Sal?I限制性酶切方法挑出含有正向插入的轉化子，并通過其瓊脂糖凝膠電泳位置確定連接小片段的數量，最終選擇含有16拷貝的BMP的轉化子，即得到16拷貝的BMP基因載體。

8.一種權利要求4所述的表達載體pPIC9的構建方法，其特征是該構建方法的步驟如下：

第一、將權利要求7構建好的含有拷貝數為16的BMP表達基因片段通過EcoR?I和Not?I雙酶切，回收含有BMP表達基因的小片段；

第二、將用于畢赤酵母的表達載體pPIC9用EcoR?I和Not?I雙酶切；

第三、將上述第一步和第二步所得的回收小片段和載體大片段通過T4?DNA連接酶連接，使含有拷貝數為16的BMP表達基因片段插入到pPIC9上而得到。

9.一種權利要求5所述的畢赤酵母工程菌株的構建方法，其特征是該構建方法的步驟如下：

第一、將權利要求8構建好的拷貝數為16的BMP表達載體pPIC9用Sac?I限制性內切酶酶切線性化；

第二、通過電擊轉化的方法將上步線性化的表達載體pPIC9導入畢赤酵母，發(fā)生重組；

第三、通過組氨酸營養(yǎng)缺陷平板篩選和PCR法鑒定，選出陽性轉化子，即得到重組畢赤酵母工程菌株。

10.一種權利要求5所述的畢赤酵母工程菌株在制備多串聯拷貝的牛肉風味肽中的應用，其特征是：該重組畢赤酵母工程菌株通過甲醇誘導，產生含有拷貝數為16的BMP多肽，并帶有一個6His標記，該標記用于Western?Blot進行產物的定性、定量分析，或與Ni柱親和，進行分離純化。