[發(fā)明專利]一種酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L－半胱氨酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710058193.6
• 申請日: 2007-07-18
• 公開（公告）號: CN101348809A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳寧;懷麗華;馬雷;徐慶陽;劉淑云
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12P13/12
• 分類號: C12P13/12;C12R1/40
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• 代理人: 暫無信息

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于氨基酸的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)酶法轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法。

【背景技術(shù)】

L-半胱氨酸(L-cysteine)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中具有活性硫(巰基)的氨基酸，目前已在醫(yī)藥、食品添加劑和化妝品中廣泛應(yīng)用。在醫(yī)藥方面，半胱氨酸及其衍生物可用于肝臟藥和解毒藥、解熱鎮(zhèn)痛藥、潰瘍治療藥、疲勞恢復(fù)劑、輸液及綜合氨基酸制劑，特別是祛痰藥。在食品方面，半胱氨酸可用作面包發(fā)酵助劑。在化妝品方面主要用于燙發(fā)精、防曬霜、養(yǎng)發(fā)精、生發(fā)水。由于在大多數(shù)微生物體內(nèi)，巰基來源于硫酸根離子，而硫酸根離子可還原為某種硫化物，因此很難用微生物發(fā)酵法制取L-半胱氨酸。我國對L-半胱氨酸的生產(chǎn)主要依靠毛發(fā)酸水解后提取L-胱氨酸，然后將L-胱氨酸經(jīng)化學(xué)或電解還原制備得到L-半胱氨酸，毛發(fā)中胱氨酸，含量約為14％，國內(nèi)目前毛發(fā)水解法的最高收率約為4.5至5.5％。用毛發(fā)酸解制取L-半胱氨酸收率低，能耗高，水解過程產(chǎn)生難聞氣體及大量廢酸，環(huán)境污染嚴(yán)重；另外，由于衛(wèi)生問題，從毛發(fā)提取的產(chǎn)品不符合醫(yī)藥的使用標(biāo)準(zhǔn)。而微生物酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-半胱氨酸具有特異性強，生產(chǎn)工藝簡單，副反應(yīng)和副產(chǎn)物少，對環(huán)境污染的程度低等優(yōu)點，將具有很好的發(fā)展前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的收率低，能耗高，環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，提供一種微生物酶法轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法。

本發(fā)明提供的一種以惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)TS-1138全細(xì)胞為酶源，酶法轉(zhuǎn)化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ2thiazoline-4-Carboxylic?Acid，DL-ATC)合成L-半胱氨酸的方法，包括：

A.將惡臭假單胞菌TS-1138進(jìn)行常規(guī)擴大培養(yǎng)

(惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)TS1138曾于2006年11月在《生物技術(shù)通訊》第17卷第6期和2007年2月在《河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報》第28卷第1期發(fā)表，現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵研究室，公眾如有需要，可直接與該研究室聯(lián)系。)

B.將步驟A中獲得的擴大培養(yǎng)的菌種接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)：產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為0.1％～30％的干基培養(yǎng)基重，氮碳比N∶C應(yīng)介于1∶100～50∶100之間，無機鹽含量應(yīng)為0.1～10％，DL-ATC的添加量為0.1％～0.9％。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始PH6.0～9.0，培養(yǎng)溫度25℃～33℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)12～36小時，接種量為0.01％～20％(V/V)；在培養(yǎng)過程中流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.2～7.0；

C.將步驟B培養(yǎng)到20～24小時，離心分離菌體10min(4000r/min，4℃)，棄去上清液，用pH?7.4的PBS緩沖液(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉-氯化鈉緩沖液)反復(fù)洗滌菌體三次并重懸，在pH?7.4的PBS緩沖液中添加的濕菌體，制備酶促反應(yīng)所用細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為100g/L～500g/L。

D.將步驟C制備的細(xì)胞懸液，加入到底物溶液中，進(jìn)行酶促反應(yīng)。其中底物溶液的濃度為0.05％～5.0％，在0～9小時加入，反應(yīng)溫度為36～42℃，反應(yīng)時間為2～12小時。酶促反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體，取上清液，采用酸式茚三酮法測定L-半胱氨酸含量。

上述B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源為：糖，即葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，山梨糖；或甘油；或低分子醇，乙醇；碳源含量最適范圍為10％～20％。

上述B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源為：氨或銨鹽，即氯化銨，硫酸銨，碳酸氫銨，硝酸銨；或有機氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵母粉，玉米漿，尿素。

上述B步產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的無機鹽為：磷酸鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，氯化鈉氨或硫酸錳。

在本發(fā)明實例中，采用酸式茚三酮法來測定L-半胱氨酸的含量，具體方法如下：精確稱取一定量L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于一定量0.05M?HCl中，制備終濃度為500mg/l的標(biāo)準(zhǔn)母液，進(jìn)一步用蒸餾水將上述母液分別稀釋為10，20，......，100mg/l的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液的稀釋液0.2mL，加入0.2mL冰醋酸，再加入0.2mL酸性茚三酮試劑，于沸水浴中反應(yīng)10min，然后立即在冷水中冷卻，最后加入2.4mL酒精，使總體積為3mL。放置10min后，于560nm下測定其吸光度，以濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出未知溶液中的半胱氨酸濃度。