[發明專利]基于dU或dI寡核苷酸探針的單核苷酸多態性檢測方法

無效

• 申請號: 200710047954.8
• 申請日: 2007-11-08
• 公開（公告）號: CN101168769A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 劉喜朋;劉建華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 毛翠瑩

技術領域

本發明涉及一種新的單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)檢測方法，尤其涉及一種基于dU或dI寡核苷酸探針的SNP檢測方法，可以用于基因多態性分析和物種分型等，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

SNP作為一種在基因組水平上由單個核苷酸的變異而導致的DNA序列多態性，在遺傳病致病基因關聯分析、連鎖不平衡分析、藥物基因組學、患者個性化治療、法醫鑒定、農作物遺傳育種等領域有著重要應用。鑒于SNP在現代生命科學中的重要地位，開發了多種SNP測定方法。但是現有SNP測定方法或檢測成本高[BMC?Genomics，2006，7：291-291]，或操作繁瑣，結果不準確，重現性差[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：2674-2678.]，或需要昂貴設備[Nucleic?Acids?Res.，2005，33：e38.]?，F在看來，還沒有一種SNP檢測技術能夠達到結果準確、操作簡便、成本低廉、檢測通量高的標準。

MutS蛋白特異性結合含有錯配堿基的雙鏈DNA，是一種極具潛力的SNP檢測工具蛋白。其中來源于嗜熱微生物Thermus?thermophilus的錯配修復蛋白TthMutS，能在高達60℃的溫度下有效識別所有8種類型的堿基錯配和1到3個堿基缺失/插入引起的錯配。

pfu?DNA聚合酶廣泛應用于聚合酶鏈式反應(PCR)，用于擴增目標核酸。然而基于pfu?DNA聚合酶的SNP檢測技術報導很少。這主要是因為pfu?DNA聚合酶具有3’外切酶活性，因此引物的3’末端堿基與模板DNA待測SNP位點的堿基不論配對與否，pfu?DNA聚合酶均能延伸引物合成全長DNA片段。因此pfu?DNA聚合酶不適合于3’末端引物延伸法檢測SNP。最近研究表明pfu?DNA聚合酶特異性緊密結合DNA中的脫氧尿嘧啶dU核苷酸與脫氨基腺嘌呤dI核苷酸，并停滯在dU或dI處，造成DNA合成反應不能順利進行。

發明內容

本發明的目的在于針對現有SNP檢測技術的不足，提供一種新的SNP檢測方法。該SNP檢測方法操作簡便，準確度高，不需要大型昂貴儀器，可用于測定各種生物的SNP。

為實現這樣的目的，在本發明中，用于測定SNP的dU或dI寡核苷酸探針具有如下特征：全長30-40個核苷酸，其中5’端第15-25位的一個核苷酸為待檢SNP位點，3’端第1-15位的一個核苷酸為dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距離待檢SNP位點5-15個核苷酸，整條寡核苷酸探針與待測單鏈DNA的SNP位點及其兩側核苷酸配對。SNP測定體系含有dU或dI寡核苷酸探針、待測單鏈DNA、報告DNA模板分子、報告DNA的正向引物與反向引物、熱穩定性mutS蛋白(例如Thermus?thermophilus的熱穩定性MutS蛋白)和pfu?DNA聚合酶等組分。若dU或dI寡核苷酸探針與待測單鏈DNA雜交形成的DNA雙鏈含有錯配堿基，則pfu?DNA聚合酶不能結合錯配堿基附近的dU或dI核苷酸，使得pfuDNA聚合酶能夠催化報告DNA的PCR；若dU或dI寡核苷酸探針與待測單鏈DNA雜交形成的DNA雙鏈不含有錯配堿基，則熱穩定性mutS蛋白不結合在該雙鏈DNA上，而pfu?DNA聚合酶可以牢牢結合寡核苷酸探針的dU或dI核苷酸，使得pfu?DNA聚合酶不能夠去催化報告DNA的PCR。

本發明的具體步驟如下：

1)設計合成測定單核苷酸多態性的dU或dI寡核苷酸探針，dU或dI寡核苷酸探針的序列特征是：探針全長30-40個核苷酸，5’端第15-25位的一個核苷酸與待測單鏈DNA的待檢單核苷酸多態性位點配對，3’端第1-15位的一個核苷酸為dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距離待檢單核苷酸多態性位點5-15個核苷酸，整條寡核苷酸探針與待測單鏈DNA的SNP位點及其兩側核苷酸配對；

2)設計合成用于擴增報告DNA的特異性正向引物和反向引物，引物的序列特征是：整條引物與報告DNA模板分子中報告DNA兩端的堿基序列配對；

3)采用熱穩定性DNA聚合酶催化的聚合酶鏈式反應擴增雙鏈DNA，聚合酶鏈式反應體系組成：熱穩定性DNA聚合酶反應緩沖液、待測單鏈DNA模板分子、待測單鏈DNA特異性引物、dNTPs和熱穩定性DNA聚合酶，其中待測單鏈DNA特異性引物中的一條采用5’端生物素標記；擴增雙鏈DNA后，將雙鏈DNA變性，與采用鏈親和素包被的磁珠溫育，在變性條件下洗滌磁珠，再用生物素溶液洗脫結合在磁珠上的待測單鏈DNA；