[發明專利]一種分離純化分子重組用膠原蛋白的方法

無效

• 申請號: 200710047700.6
• 申請日: 2007-11-01
• 公開（公告）號: CN101157719A
• 公開（公告）日: 2008-04-09
• 發明（設計）人: 吳文惠;朱夕波;張艷;包斌;王南平;李燕;繆輝南
• 申請（專利權）人: 上海水產大學
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/12;C07K1/16;C07K14/47
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于膠原蛋白的技術領域，具體涉及一種分子重組用膠原蛋白的分離純化方法。

背景技術

膠原蛋白是存在于細胞間質的結構蛋白質，廣泛分布于動物結締組織中。膠原蛋白構成的膠原纖維使動物結締組織具有良好的彈性、延展性和韌性。由于膠原蛋白具有易于設計和修飾的基本單元氨基酸、沒有細胞毒性、可調控的生物降解速度、能特異促進或抑制細胞-材料的相互作用、能引發的免疫反應和炎癥最小、容易純化和處理、與水溶液和生理條件的生物化學相容性優良等諸多優點。在組織工程領域自然生物材料膠原蛋白具有廣闊的應用前景，從海洋生物的結締組織如皮膚等組織獲取的膠原蛋白與陸地生物來源的膠原蛋白相比又具有最大限度的生物安全性，所以，海洋生物膠原蛋白是作為生物醫藥材料的最佳天然材料。

膠原蛋白作為生物醫學材料有顯著的功能特性，但也存在不足，通過物理交聯、化學試劑交聯和通過與其它高分子材料共混等方法保持膠原蛋白生物活性的同時，并賦予新的功能，近幾年將不同天然高分子進行共混雜化形成的復合材料顯示出了其它材料無法替代的優點和性能，是目前研究和開發生物材料的熱點。

圍繞著保持膠原蛋白的天然分子結構和分子重組用生物材料的安全性，發明者確定了在溫和條件下分離鯊魚頭皮膠原蛋白的制造工藝并且表征了分子重組用膠原蛋白的特性。

發明內容

本發明的目的是提供一種分子重組用膠原蛋白分離純化方法，使制備獲得的膠原蛋白能較好的維持天然存在的膠原蛋白的空間結構特征，經分子重組后，能制成抗滲漏性好、降解時間長的生物醫學工程材料，可作為靜動脈血管再造等要求較高的各類醫療手術材料。

本發明以鯊魚頭皮為材料，通過不同濃度的緩沖液依次浸泡、鹽析、層析等方法提取和純化膠原蛋白，具體步驟如下：

將鯊魚頭皮用濃度為10-20mmol/L、pH值為7.4-7.6的磷酸緩沖液浸泡、沖洗，去掉鱗和殘肉，切成(0.3-0.6cm)×(0.3-0.6cm)小塊；再用去離子水浸泡沖洗，清洗干凈的鯊魚頭皮用濃度為50-100mmol/L、pH值為7.4-7.6的磷酸緩沖液浸泡處理50-80小時，勻漿；低溫(2℃-8℃)中速(3000-5000r/min)離心，取上清液。上清液用高飽和度硫酸銨鹽析，低溫中速(同前)離心，保留沉淀物。將沉淀物溶在濃度為150-250mmol/L、pH值為6.8-7.2的磷酸緩沖液中。用葡聚糖凝膠層析，收集蛋白洗脫液，濃縮，再真空冷凍干燥，即得所需膠原蛋白。

本發明具有以下優點：

1、具有較低的價格。作為下腳料的鯊魚頭皮作為膠原蛋白提取的原料，原料豐富，價格低廉。

2、最大限度維持了天然膠原蛋白的結構特征，獲得的膠原蛋白具有最高的生物安全性。

3、有利于分子重組的進行。

4、所得鯊魚頭皮膠原蛋白能溶于中性及酸性溶液中，較之其他來源的膠原蛋白有更大的溶解性，能應用于更多領域。

5、制備分子重組用膠原蛋白的工藝不會污染環境。

本發明原料也可以采用鯊魚其他部位的皮膚。

具體實施方式

在溫和的提取條件下，以青鯊頭皮為原料分離純化分子重組用膠原蛋白的方法如下：

(1)將冰凍保存的青鯊頭皮30g用磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7.4-7.6)浸泡沖洗去掉鱗和殘肉，切成0.5cm×0.5cm小塊，再用去離子水浸泡沖洗3～5次。

(2)清洗干凈的魚皮用磷酸鹽緩沖液250ml(100mM，pH7.4-7.6)浸泡72小時，然后勻漿5min，4℃、10000rpm離心15min，取上清液。

(3)沉淀重復(2)的過程一次，合并上清液，加硫酸銨至飽和度70％-80％，離心(8000rpm，4℃，15min)，保留沉淀物。

(4)將沉淀物溶在約20ml磷酸鹽緩沖液(200mM，pH7.0，1.5g/ml)中。

(5)以磷酸鹽緩沖液(200mM，pH7.0)為洗脫液，用葡聚糖G-150層析上述溶解液，收集蛋白洗脫液，濃縮，真空冷凍干燥后得到分子重組用膠原蛋白。

經上述分離、純化的青鯊頭皮膠原蛋白在濃縮膠4-5％、分離膠7.5-8％的SDS-PAGE上只體現清晰的三條譜帶，三條譜帶的分子量從低到高分別是118kDa，134kDa和205kDa。從青鯊頭皮分離到的膠原蛋白的變性溫度是47.21℃。從青鯊頭皮分離的膠原蛋白其二級結構以β-折疊為主，并包含有無規卷曲。該膠原蛋白的分子重組材料能作為靜動脈血管再造等要求較高的醫療手術材料。

分子重組膠原蛋白的制備方法如下：

將由上述方法制備的膠原蛋白0.8-1.0g，溶于45-55ml濃度為2.5-3.5mg/ml?1-乙基-3-(3-二甲丙氨基)碳化二酰亞胺和5.4-5.8mg/ml羥基琥珀酰亞胺的pH值為5-6溶液中，室溫保持2-2.5小時，完成交聯化。離心(3000-4000rpm，5-6min，室溫)之后，除去上清液，添加50-55ml?Na₂HPO₄(0.1-0.15M)室溫保持2-2.5小時。用上述條件離心，除去上清液，用無離子水清洗3次，真空冷凍干燥，獲得分子重組膠原蛋白。