[發(fā)明專利]體外篩選胰高血糖素樣肽－1受體的多肽類激動(dòng)劑的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710042364.6
• 申請(qǐng)日: 2007-06-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101113982A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏東芝;馬昱澍;殷曉浦;劉美云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/566;A61K38/26;A61P3/10
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 余明偉;許亦琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多肽類藥物體外篩選方法，尤其涉及胰高血糖素樣肽-1受體的多肽類激動(dòng)劑的體外篩選方法及篩選得到的多肽。

背景技術(shù)

目前篩選胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1受體)的激動(dòng)劑的方法是將GLP-1受體的基因與報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，并將GLP-1受體表達(dá)在細(xì)胞表面，針對(duì)激動(dòng)劑進(jìn)行篩選。

中科院上海藥物研究所的王明偉研究員等利用穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染GLP-1受體和一個(gè)cAMP報(bào)告因子的細(xì)胞系，從化合物文庫(kù)中近5萬(wàn)化合物中進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)候選環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)：S4P和Boc5，能在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠活體模型上模擬胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的活性。其中Boc5注射或口服給藥后成功降低了小鼠的攝食量。在II型糖尿病小鼠模型中，每日注射Boc5可以防止體重增長(zhǎng)，降低糖化血紅蛋白(血糖長(zhǎng)期控制指標(biāo))。因此研究人員認(rèn)為Boc5可能代表了一類全新的、無(wú)需注射的小分子，可用于治療糖尿病、肥胖癥及相關(guān)代謝性疾病。(Chen?D，Liao?J，Li?N，Zhou?C，Liu?Q，Wang?G?Zhang?R，Zhang?S，Lin?L，Chen?K，Xie?x，Nan?F，Young?AA，WangMW.A?nonpeptidic?agonist?of?glucagon-like?peptide?1?receptors?with?efficacy?in?diabetic?db/db?mice.Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A.2007?Jan?16；104(3)：943-8.Epub?2007?Jan?9.)

重慶工商大學(xué)的殷菲等利用GLP-1受體和報(bào)告基因建立穩(wěn)定的GLP-1受體激動(dòng)劑篩選模型，從天然藥物中篩選活性成分，并在PC12細(xì)胞中驗(yàn)證GLP-1受體激動(dòng)劑的功能及作用機(jī)制。經(jīng)過(guò)篩選、鑒定表明京尼平苷是一種新的GLP-1受體激動(dòng)劑，能夠通過(guò)MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化，對(duì)抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷，提高神經(jīng)細(xì)胞活力。因此京尼平苷具有與GLP-1受體激動(dòng)劑類似的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)功能。(殷菲，鄧小紅，景佳佳，鄭旭煦，劉建輝.胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)的高通量篩選及作用機(jī)制研究.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(1)，24-27.)

南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的陳家琪等用大鼠胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)基因，轉(zhuǎn)染帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的CHO細(xì)胞，成功地構(gòu)建了基于G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的CHO/EGFP/GLP-1R檢測(cè)細(xì)胞系。該細(xì)胞系能功能性表達(dá)GLP-1R并且能通過(guò)cAMP偶聯(lián)的EGFP報(bào)告基因的表達(dá)，來(lái)評(píng)價(jià)GLP-1R激動(dòng)劑的活性。利用該細(xì)胞系進(jìn)一步對(duì)5種GLP-1與金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)不同形式連接的融合蛋白進(jìn)行了體外活性驗(yàn)證。結(jié)果表明，利用CHO/EGFP/GLP-1R細(xì)胞系，能夠?qū)LP-1及其類似物的體外活性進(jìn)行定性和定量的分析，為篩選和開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效GLP-1類似物奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。(陳家琪，高智慧，朱元元，楊文博，白鋼.胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑功能性報(bào)告基因分析系統(tǒng)的構(gòu)建.南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，40(1)，92-98.)

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的體外篩選胰高血糖素樣肽-1受體的多肽類激動(dòng)劑的方法及篩選得到的多肽。

本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思如下：

有文獻(xiàn)報(bào)道，可利用基因工程制備的重組GLP-1受體的膜外N端片段來(lái)研究其與GLP-1、exendin-4的結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)表明GLP-1、exendin-4與重組的GLP-1受體膜外N端片段保持正常的親和力。有人利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞分別表達(dá)大鼠肺中GLP-1受體的cDNA和胰島中GLP-1受體的cDNA，并進(jìn)行藥理學(xué)研究，其結(jié)果無(wú)顯著性差異。因此，本發(fā)明以重組的GLP-1受體蛋白的膜外N端片段(N-GLP-1R)為靶點(diǎn)，利用其體外結(jié)合能力，并結(jié)合噬菌體展示技術(shù)和Phage-ELISA技術(shù)，建立了簡(jiǎn)便、快捷的體外高通量篩選GLP-1受體多肽類激動(dòng)劑的方法，即篩選潛在的糖尿病藥物的方法。

本發(fā)明一方面公開(kāi)了一種體外篩選胰高血糖素樣肽-1受體的多肽類激動(dòng)劑的方法，包括下列步驟：

1、采用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建待選GLP-1受體的多肽類激動(dòng)劑的噬菌體展示文庫(kù)；

2、先將N-GLP-1R包被在微孔反應(yīng)板上，再將噬菌體展示文庫(kù)加入微孔與包被的

N-GLP-1R相互作用，而后將與N-GLP-1R特異性結(jié)合的噬菌體從微孔反應(yīng)板上洗下，獲得與N-GLP-1R特異性結(jié)合的噬菌體；